從早期序列比對工具Needleman-Wunsch、Smith-Waterman到后來的Clustal算法，以及近幾年的Muscle、MAFFT序列比對算法。算法在向更快、更精確、能處理更多數(shù)據(jù)這些方向進行緩慢而有力的發(fā)展。常用的在線序列比對工具主要由EMBL-EBI提供，包括但不限于Needle, Water, Clustal Omega, Muscle, Mafft, T-coffee等，以及NCBI提供的blast2seq工具；常用的序列相似性搜索工具有NCBI提供的BLAST、UCSC提供的BLAT等。EMBL-EBI與NCBI同時期也開發(fā)了一套序列相似性搜索工具FASTA，然后最終沒能流行起來。BLAST一家獨大，BLAT依賴UCSC占據(jù)一點小市場，F(xiàn)ASTA的親爹同時提供了FASTA及BLAST服務，可能現(xiàn)在說FASTA人們只會想到FASTA文件格式吧。EMBL-EBI提供大量的對比工具在線服務，并不代表其擁有這些工具的所有權。
按工具功能大致可以分為3類：配對序列比對工具，多序列比對工具以及序列相似性搜索工具。
配對序列比對是用來研究兩條序列（核酸序列或者蛋白序列）之間功能、結構或者進化關系。
多序列比對工具當然也支持配對序列比對，不過更多的是用來比對3條及以上序列，研究序列之間是否同源以及序列間的進化關系。
序列相似性搜索工具主要是在一個序列數(shù)據(jù)庫中查找一條序列，找出與查詢序列最相似的序列。
配對序列比對工具
工具集網(wǎng)址：
https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/
這些可能是史前比對工具了，現(xiàn)在估計沒有什么人在用了，可能也沒人聽過還有這樣的工具存在。但是他大爺畢竟是他大爺，如果想比對兩條序列全局情況，Needle仍是不錯的選擇，至于Smith-Waterman算法，在許多二代比對算法里仍可見，比如bwa-sw算法，Minimap2計算overlap時使用的也是Smith-Waterman算法；Smith-Waterman也擁有CUDA版本程序。
Needle比對工具
以Needle工具為例進行一下簡單的演示，其提供了核酸及蛋白比對兩個版本，比對不同類型的序列需要選擇不同的工具。Needle是全局比對工具，將兩條序列全部內部進行比對并展示。
1. 打開Needle核酸比對工具頁面
https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html
2. 輸入兩條需要比對的序列
一個文本框里輸入一條FASTA記錄，其他參數(shù)不需要調整。
3. 查看結果
Needle的結果看起來是非常友好的，類似于NCBI BLAST顯示結果，
多序列比對工具
工具集網(wǎng)址：
https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/
該主頁提供了多款多序列比對工具，其中Clustal Omega結果形式是全局比對形式，但是算法還是局部比對算法，不建議在分子進化樹分析過程使用Clustal相關程序，因為其速度及準確度均遜色于下述的MAFFT及MUSCLE。
下表列出了常用的多序列比對工具，在平時學習或者工作中建議使用MAFFT或者MUSCLE進行多序列比對。
MAFFT比對工具
MAFFT是2002年開發(fā)的一款快速的局部/全局多序列比對工具，與之相對的是2004年開發(fā)的MUSCLE多序列比對工具，在網(wǎng)頁使用過程中，兩者差異不明顯，但是MUSCLE在比對數(shù)百條、數(shù)千條序列時，速度較慢，這時候使用MAFFT效果會好一點。
1. 打開MAFFT主頁
https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/
2. 輸入自己想要進行比對的多序列
支持2條以上序列比對，目前EMBL-EBI提供的網(wǎng)頁版本MAFFT最大支持500條序列且文件大小不超過1MB（差不多1,000,000bp的堿基）。如果自己提交的文件較大，可以在提交時勾選Be notified by email。這樣在比對完成時，EMBL-EBI會郵件通知你比對結果。
3. 查看結果
提交任務，過一段時間后就可以查看到比對結果了。其中Phylogenetic Tree可以查看分子進化樹。
不同序列比對工具對比
其他工具使用方式與MAFFT一致，相對于ClustalW/Clustal Omega，MAFFT及MUSCLE比對結果無計數(shù)。但是MAFFT及MUSCLE在處理INDEL時，效果比ClustalW/Clustal Omega要好。
相同兩條序列不同軟件比對結果
可以很明顯的看出各種工具對INDEL的處理，這主要是不同工具使用算法不同有關。Clustal，Water及blast2seq，在遇到Gap及Gap持續(xù)延長時，比對分值線性下降，而其他幾種算法在遇到Gap及Gap持續(xù)延長時，比對分值會下降但不會低于0，不會線性下降。
序列相似性搜索工具
工具集網(wǎng)址：
https://www.ebi.ac.uk/Tools/sss
EMBL-EBI提供了FASTA及BLAST兩款序列相似性搜索工具，不過序列相似性工具還是使用NCBI的BLAST以及UCSC的BLAT比較好。
NCBI BLAST
BLAST是目前最常用的生信工具之一，NCBI圍繞BLAST開發(fā)了大量的周邊工具，比如引物設計及特異性驗證工具Primer-BLAST。
1.打開BLAST主頁
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
其提供了4款BLAST子工具，常用的是核酸BLAST以及蛋白BLAST，點擊核酸BLAST進入工具內部。
2. 選擇適合的參數(shù)進行搜索
3. 搜索結果查看
有疑問可以點擊整個頁面右上角的HELP，進行個人自助。
4. 圖形化瀏覽比對結果
這里又可以使用NCBI強大的基因組瀏覽功能了，可以添加自己想要的track進行數(shù)據(jù)關聯(lián)展示，可惜好多人不太喜歡這個功能。
UCSC BLAT
1.打開BLAT主頁
https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat
2. 選擇合適參數(shù)進行序列搜索
3. 搜索結果查看
詳細結果支持兩種查看方式：基因組瀏覽器以及文本形式。基因組瀏覽器形式可以查看全局比對情況，以及匹配區(qū)域在基因組中的位置、注釋等情況，文本形式可以詳細的查看比對結果。
4. 基因組瀏覽器查看比對結果
5. 文本形式比對結果
BLAT更多體現(xiàn)的是一個定位功能，將查詢序列定位到目標基因組上，而BLAST更加的是搜索功能，從序列數(shù)據(jù)庫中搜索出與查詢序列接近的目標序列。
總結：
對于鏈相反的序列比對建議使用blast2seq；
對于序列相似，想要查看序列全局比對的建議使用needle及MAFFT；
對于多條序列比對，建議使用MAFFTT；
實在特別想要Clustal計數(shù)形式結果，建議使用Clustal Omega或者Needle；
想做多條序列分子進化樹，建議MAFFT；
未知序列搜索，想要研究序列功能可以使用blast，速度稍慢，但搜索庫數(shù)據(jù)量大；
某一物種未知序列定位，建議使用blat，速度快。
