Alveolar progenitor and stem cells in lung development, renewal and cancer (review)

Abstract:

Alveoli are gas-exchange sacs lined by squamous alveolar type (AT) 1 cells and cuboidal, surfactant-secreting AT2 cells.Classical studies suggested that AT1 arise from AT2 cells, but recent studies propose other sources. Here we use molecular markers, lineage tracing and clonal analysis to map alveolar progenitors throughout the mouse lifespan. We show that, during development, AT1 andAT2 cells arise directly froma bipotent progenitor, whereas after birth new AT1 cells derive from rare, self-renewing, long-lived, mature AT2 cells that produce slowly expanding clonal foci of alveolar renewal. This stem-cell function is broadly activated by AT1 injury, and AT2 self-renewal is selectively induced by EGFR (epidermal growth factor receptor) ligands in vitro and oncogenic Kras(G12D) in vivo, efficiently generating multifocal, clonal adenomas. Thus, there is a switch after birth, when AT2 cells function as stem cells that contribute to alveolar renewal, repair and cancer. We propose that local signals regulate AT2 stem-cell activity: a signal transduced by EGFR-KRAS controls self-renewal and is hijacked during oncogenesis, whereas another signal controls reprogramming to AT1 fate.

肺泡是由AT1和AT2細胞構成的氣體交換的組織囊狀結構。AT1是呈鱗片狀上皮細胞，AT2細胞是具有分泌表面活性物質功能的柱狀上皮細胞。傳統(tǒng)的觀點認為 AT1細胞源于AT2細胞。但最新的研究提出了新的觀點。該研究采用了分子標記，細胞譜系追蹤，克隆分析的方法來繪制小鼠一生中肺泡祖細胞的圖譜。結果表明，在發(fā)育階段，AT1和AT2細胞均直接來源于雙向潛能的祖細胞。而在出生后，新生的AT1細胞來自于罕見的、自我更新的、長壽的、成熟的AT2細胞，這些AT2細胞能夠產生緩慢擴大的肺泡自我更新的灶點。AT1損傷能夠廣泛激活這種AT2細胞的干細胞功能。此外，體外EGFR(表皮生長因子受體)配體和體內致癌因子Kras(G12D)選擇性誘導能夠自我更新的AT2細胞，有效地產生多灶性的腺瘤。因此，AT2細胞作為參與肺泡更新、修復和癌變的干細胞，其功能在出生后就會發(fā)生重大轉變。該研究提出，局部信號能調控AT2干細胞活性:一個EGFR-KRAS轉導的信號控制AT2細胞的自我更新并在腫瘤發(fā)生過程中被劫持，而另一個信號控制AT1命運的重新編程。

AT1和AT2細胞產生于雙向潛能祖細胞

成熟的AT1和AT2細胞在出生前1天左右出現，此時遠端小管開始擴張（囊狀化）。該研究選取了15個已知的AT1和AT2的分子標記分析氣道中遠端(祖細胞)和近端(at1和at2細胞)位置標記在肺囊狀化過程中的轉變，來推斷肺泡上皮細胞分化過程中分子標記動態(tài)表達的變化過程。結果發(fā)現有表達了AT1和AT2標記的雙向潛能的祖細胞在分化的早期(E)或晚期(L)關閉表達某種類型的的細胞類型標記物，在細胞成熟的后期(L)開啟特定細胞類型特異性標記物(A1L、A2L)，從而產生AT1或AT2細胞。
此外還有三方面的證據支持雙向潛能祖細胞模型：
（1）細胞克隆分析表明局部肺泡譜系簇具有明顯的AT1和AT2細胞標記。
（2）亞顯微結構分析發(fā)現明顯的三類遠端肺泡上皮細胞：有糖原液泡但無板層體的立方細胞(雙能祖細胞)，有液泡和板層體的立方細胞(早期at2細胞)，有液泡的部分扁平細胞(早期AT1細胞)。
（3）細胞譜系追蹤分析表明，利用溶菌酶(Lyz2)位點的Cre重組酶敲入(LysM-Cre)新分化的AT2細胞，在后期只有AT2細胞被標記上而AT1細胞沒有被標記上。
在肺囊狀化的過程及其之后的幾周內，幾乎沒有檢測到上皮細胞的增殖。這表明在發(fā)育期雙向潛能祖細胞產生了絕大多數甚至全部的AT1和AT2細胞。

少量AT2細胞激活的肺泡自我更新灶點

經典的放射自顯影研究表明，肺泡上皮是一種通過彌漫性增殖(可能是AT2細胞)維持的緩慢更新的細胞群。該研究使用了兩個標記進行體內細胞譜系追蹤以研究AT2細胞維持的作用，SftpC–Cre–ER（祖細胞和AT2中均表達）和LysM–Cre（僅在成熟的AT2中表達）。在標記后2個月(SftpC–Cre–ER)或出生后2個月(LysM–Cre)，兩種細胞系在整個肺內均有明顯標記的AT2細胞，顯示散在的at1細胞標記有AT2譜系標記。AT2細胞對細支氣管譜系的細胞包括Clara、纖毛細胞和神經內分泌細胞的維持作用不顯著。
為了研究AT2細胞更新AT1的頻率和空間定位，使用LysM-Cre對上述肺進行標記，并對1、2、4、8和16個月大的肺進行分析。AT1細胞在1個月時表達AT2譜系標記不足1%，4個月時表達3.9%，16個月時表達7.5%。AT1細胞的更新主要發(fā)生在毗鄰小動脈的肺泡和肺周圍。當新的AT1細胞出現時，肺泡基本上被替換為一半或全部，這表明肺泡只包含一兩個AT1細胞。隨著年齡的增長，相鄰的肺泡單位也會更新，這可以通過使用AT2譜系標記的AT1細胞群緩慢擴大來證明。這些更新的AT1區(qū)域除了攜帶有AT2的標記，與其他區(qū)域無差別。結果表明AT1被AT2細胞更新是間歇性的，并且在空間上呈斑片狀分布，隨著時間的推移，“更新灶”逐漸擴大，血管周圍和周圍區(qū)域作為相對的“熱點”。

更新灶來自單個分化的AT2細胞

每個更新灶可以來自單個AT2細胞，在這種情況下，這些細胞可能是單細胞克隆而來的或者來自多個AT2細胞。為了區(qū)分這些可能性，使用了一個依賴于CRE的多彩的報告基因（CFP），該基因隨機地在每個經歷重組的細胞中表達四種熒光蛋白中的一種。通過分析膜CFP譜系標記，發(fā)現更新灶的大小和漸進性擴大與使用單色報告器觀察到的相似，這表明更新灶起源于單一的AT2細胞。由于lysmc - cre 的CFP重組效率較低(在16個月內2%的AT2細胞表達膜靶向CFP譜系標記)，我們能夠在更新灶內識別標記的AT2細胞。大多數更新灶內含有一個或兩個AT2細胞和多個AT1細胞子代分布于六個相鄰的肺泡中。我們還觀察到只有AT2細胞組成的小克隆灶，表明它們能夠在不形成AT1細胞(自復制)的情況下進行分裂。初始的AT2細胞表達成熟AT2標記物，包括LAMP-1，一種溶酶體相關蛋白，表明它們能夠產生表面活性劑。以上結果表明，每個更新灶都來自一個可以生成多個AT1或AT2的自更新AT2細胞。

急性AT1細胞損傷激活AT2細胞

氧張力升高對AT1細胞有毒性，但對AT2細胞沒有毒性。2個月大的老鼠攜帶AT2譜系標記，暴露在氧含量達到88%環(huán)境中120小時，這使更新的AT1細胞數量增加了兩倍。這一發(fā)現表明，AT2細胞在高氧損傷后會被激活，這支持了一種觀點：即盡管正常情況下只有極少數AT2細胞執(zhí)行干細胞功能，但也可以招募其他細胞來修復肺泡損傷。

致癌的Kras信號選擇性地激活AT2自我更新

腺癌是肺癌的主要形式，其發(fā)生與Kras或Egfr突變的激活有關。腺癌通常位于肺周圍區(qū)域，幾乎所有的腫瘤細胞都表達SftpC，這導致長期以來人們猜測它們起源于AT2細胞或其祖細胞。通過基因敲入手段用致癌的Kras (G12D)突變替換野生型小鼠的Kras位點，腫瘤結節(jié)在整個肺內迅速生長，誘導后1個月幾乎整個肺泡區(qū)域被置換，隨后不久即死亡。最大的腫瘤發(fā)生在血管周圍和肺周圍區(qū)域，這些區(qū)域與AT2細胞的更新灶基本一致。SftpC–Cre–ER激活成年小鼠的Kras(G12D)可產生類似的結果。但是，CCSP–Cre–ER和ROSA–Cre–ER的誘導則影響較小。由腺瘤組成的轉化AT2細胞繼續(xù)表達AT2標記物(Nkx2.1, SftpD)，沒有表達Clara標記物(CCSP)或AT1標記物(極少)。因此，致癌的Kras(G12D)似乎可以選擇性地永久誘導AT2的自我更新，而不需要將細胞去編程為雙能祖細胞，也不需要重新編程為AT1或Clara細胞的命運。

EGFR的活性控制AT2在培養(yǎng)中的自我更新

雙向潛能祖細胞和AT2細胞的轉錄組分析表明它們都表達Egfr，和兩個EGFR成員Erbb2和Erbb3。純化后的AT2細胞具有強勁的增殖能力和AT1細胞的分化能力。此外純化的EGF配體促進AT2的增殖，而封閉EGFR的抗體抑制AT2的增殖。