Development of Tumor Mutation Burden-Related Prognostic Model and Novel Biomarker Identification in Stomach Adenocarcinoma
腫瘤突變負(fù)擔(dān)相關(guān)的預(yù)后模型的開發(fā)和新的生物標(biāo)記物的鑒定在胃腺癌中的應(yīng)用
發(fā)表期刊：Front Cell Dev Biol
發(fā)表日期：2022 Mar 23
影響因子：6.081
DOI:? 10.3389/fcell.2022.790920
一、背景
????????胃癌（GC）是第三大最常見的癌癥相關(guān)死亡病例，其中STAD是最常見的病理組織類型。STAD的病因仍不清楚；許多因素包括幽門螺桿菌感染、吸煙、環(huán)境因素、毒物接觸史等都與STAD的發(fā)生有關(guān)。免疫治療是一種新開發(fā)的方法，通過靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4等來治療腫瘤。免疫療法與常規(guī)治療相結(jié)合的一線臨床試驗顯示，胃癌患者的臨床獲益和生存率有所提高，特別是在預(yù)處理的患者中。
????????以前的研究指出了免疫治療反應(yīng)和TMB之間的相關(guān)性。腫瘤組織中的基因突變可能通過轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生新的抗原，從而被免疫系統(tǒng)識別和鎖定。TMB可以作為生物標(biāo)志物來預(yù)測晚期胃癌患者接受免疫治療后的生存率，這有助于醫(yī)生做出最佳決策。
二、材料與方法
1、 數(shù)據(jù)來源
1）TCGA：STAD患者的各種數(shù)據(jù)，包括突變數(shù)據(jù)、基因表達(dá)譜和臨床數(shù)據(jù)
2）STAD探針矩陣文件（GSE84433系列矩陣）和平臺文件（GPL6947-13512）
3）外部驗證組（GSE84433）、GSE62254
4）人胃癌細(xì)胞系（BGC823,MKN45）
2、 分析流程
1）數(shù)據(jù)采集：以TMB的中位數(shù)為臨界值，將STAD樣本分為高和低TMB組；使用limma軟件包分析高和低TMB組的基因表達(dá)數(shù)據(jù)
2）DEGs富集分析和免疫浸潤評估：使用GSEA軟件進(jìn)行基因集富集分析（GSEA），并報告了在高TMB組（與低TMB組相比）富集最明顯的前五個GO關(guān)鍵詞和KEGG途徑；CIBERSORT
3）突變數(shù)據(jù)的可視化和ssGSEA分析：使用GSVA包在TCGA-STAD樣本中進(jìn)行ssGSEA分析，以確定23個免疫相關(guān)基因組的免疫活性；ESTIMATE算法，創(chuàng)建腫瘤微環(huán)境；使用ssGSEA方法計算了TCGA數(shù)據(jù)庫中每個STAD樣本的腫瘤免疫細(xì)胞浸潤得分，使用 " Limma "包運行免疫評分和免疫分型的差異分析
4）免疫預(yù)后模型的構(gòu)建和多重驗證：通過ImmPort數(shù)據(jù)庫中的免疫相關(guān)基因列表與前面的DEGs相交，獲得差異表達(dá)的免疫基因；變量COX分析、LASSO、多變量Cox回歸分析
5）模型基因的突變和CNV：cBioportal網(wǎng)站，選擇研究（胃腺癌TCGA PanCancer數(shù)據(jù)），下載模型基因的突變情況；TIMER
6）免疫治療效益評估和模型比較：分析了一系列免疫治療的生物標(biāo)志物；TIDE數(shù)據(jù)庫，獲得每個樣本的TIDE、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）、功能障礙和排異評分，研究高風(fēng)險組和低風(fēng)險組之間的差異
7）藥物敏感度測試：從CellMiner數(shù)據(jù)庫下載了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和FDA認(rèn)證的藥物敏感性相關(guān)數(shù)據(jù)，以明確預(yù)后模型中的模型基因?qū)λ幬锩舾行院湍褪苄缘挠绊?/p>
8）細(xì)胞實驗：細(xì)胞培養(yǎng)和siRNA處理、定量實時PCR、蛋白印跡分析、細(xì)胞增殖和菌落形成試驗、跨孔遷移和傷口愈合試驗
三、實驗結(jié)果
01 - STAD的主要基因改變和統(tǒng)計分析
????????應(yīng)用Maftools對突變數(shù)據(jù)進(jìn)行總結(jié)，根據(jù)變異效應(yīng)預(yù)測器進(jìn)一步對突變進(jìn)行分類，其中錯義突變的頻率最高（圖1A）。在所有突變類型中，SNP的發(fā)生頻率最高（圖1B）。同樣，STAD中最頻繁的SNV類型是C>T轉(zhuǎn)位（圖1C）。圖D顯示了每個樣本的突變情況，這與TMB最相關(guān)（圖1D）。圖E也描述了樣本的突變情況（圖1E）。前10個突變的基因是TTN、MUC16、TP53、LRP1B、ARID1A、SYNE1、FAT4、CSMD3、FLG和PCLO（圖1F）。
????????瀑布圖以圖形方式顯示了樣本的基因突變情況（圖2）。相關(guān)圖直觀地顯示了兩個基因突變之間的相關(guān)性；例如，PIK3CA和ARID1A的突變共同出現(xiàn)，而PIK3CA和TP53的突變則相互排斥（圖3）。
????????根據(jù)TMB的中位數(shù)，將STAD患者分為兩組：高TMB和低TMB。根據(jù)KM生存分析，高TMB組患者的生存率高于低TMB組的患者（補(bǔ)充圖S1A）。結(jié)果顯示，在STAD中，TMB與年齡有良好的聯(lián)系，與分期、T期和N期呈負(fù)相關(guān)；女性患者的TMB高于男性患者。女性患者的TMB高于男性個體（補(bǔ)充圖S1B-H）。在高和低TMB組之間，發(fā)現(xiàn)了816個DEGs。
02 - GSEA富集和免疫浸潤分析
????????使用GSEA富集分析比較高、低TMB組，得到高TMB組中富集度最高的前5個GO關(guān)鍵詞（圖4A-E）和KEGG通路（圖4F-J）。這些KEGG途徑和GO關(guān)鍵詞大多與遺傳物質(zhì)代謝和DNA修復(fù)有關(guān)。
????????根據(jù)研究，腫瘤中TMB越高，產(chǎn)生的新抗原越多，使腫瘤更具免疫原性。因此，作者研究了STAD中TMB和免疫標(biāo)志物之間的聯(lián)系，使用CIBERSORT確定了浸潤的免疫細(xì)胞的比例。這些發(fā)現(xiàn)表明，高TMB腫瘤包括高比例的濾泡輔助T細(xì)胞、激活的記憶型CD4+T細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。靜止的記憶性CD4+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、單核細(xì)胞、靜止的樹突狀細(xì)胞和靜止的肥大細(xì)胞在低TMB組中都比較高（圖5）。
03 - 預(yù)測模型的構(gòu)建和驗證
? ? ? ? 將免疫相關(guān)基因和先前的DEGs的重疊，得出差異表達(dá)的免疫基因。采用一次性隨機(jī)分組來建立訓(xùn)練組和內(nèi)部驗證組。根據(jù)訓(xùn)練組的單變量COX分析，應(yīng)用LASSO算法來處理21個與生存相關(guān)的免疫基因。在逐步進(jìn)行多變量Cox回歸分析后，有四個免疫基因能夠形成預(yù)測模型。每個病人的風(fēng)險分?jǐn)?shù)（RiskScore）計算如下：0.001*APOD +0.005*APOH +0.039*INHA +0.499*GLP2R。每個模型基因都被認(rèn)為具有高風(fēng)險屬性。
????????作者將訓(xùn)練組、內(nèi)部驗證組、總組和外部驗證組的患者分成高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，在計算他們的風(fēng)險分?jǐn)?shù)后，進(jìn)行后期的生存分析。訓(xùn)練組、內(nèi)部驗證組、總組和外部驗證組中的高風(fēng)險組和低風(fēng)險組的生存曲線明顯不同，低風(fēng)險組的生存率明顯大于高風(fēng)險組的。根據(jù)ROC曲線的曲線下面積（AUC）值（圖6），建立的預(yù)后模型的準(zhǔn)確性是可靠的。最終，單變量和多變量的預(yù)后研究顯示，從模型中得出的風(fēng)險分?jǐn)?shù)是一個獨立于其他因素的預(yù)后因素。
????????建立模型基因的Boxplots來計算高風(fēng)險組和低風(fēng)險組之間的表達(dá)水平差異（圖7A-D）。高危組的所有模型基因的表達(dá)量都明顯較高，這驗證了先前的推斷，即所有模型基因都屬于高危因素。此外，在多基因生存研究中納入所有模型基因，成功驗證了預(yù)后模型的效率（圖7E）。為了提高研究的臨床轉(zhuǎn)化意義，成功地設(shè)計了一個在線的動態(tài)Nomograph App，以快速計算病人的生存率，支持臨床決策。
????????cBioportal網(wǎng)站提供了模型基因的遺傳變化的整體視圖（圖8A），以及領(lǐng)域突變圖（圖8B-E）。這些模型基因的突變頻率極低。
????????根據(jù)TIMER數(shù)據(jù)庫，這些模型基因的CNV對免疫細(xì)胞浸潤水平差異影響不大（圖9A-D），只有巨噬細(xì)胞浸潤對STAD患者的生存有實質(zhì)性影響（圖9E）。
????????作者通過分析風(fēng)險分類和腫瘤微環(huán)境之間的相關(guān)性，創(chuàng)建了腫瘤微環(huán)境的熱圖（圖10A）和小提琴圖（圖10B-E）?？傊唢L(fēng)險組的StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore高于低風(fēng)險組，而低風(fēng)險組的TumorPurity得分更高。為了研究風(fēng)險分?jǐn)?shù)和免疫狀態(tài)之間的關(guān)系，用ssGSEA方法對23個免疫細(xì)胞亞群進(jìn)行了量化，發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險組13個免疫細(xì)胞亞群的浸潤明顯高于低風(fēng)險組(圖10F）。
????????高危組的TIDE評分較高，MSI評分較低，Dysfunction評分較高，Exclusion評分較高，說明STAD高危組的免疫逃逸潛力增大，導(dǎo)致免疫治療效果不佳（圖11A）。最后，從5年的ROC曲線可以判斷，構(gòu)建的預(yù)后模型的AUC值最大，所以其預(yù)后預(yù)測效率高于TIDE評分和TIS評分（圖11B）。上述結(jié)果表明，GLP2R高表達(dá)組的風(fēng)險得分最高，預(yù)后最差。
04 - 藥物敏感度測試
????????通過對預(yù)后模型中的模型基因進(jìn)行單獨的藥物敏感性分析，作者能夠確定具有最顯著統(tǒng)計學(xué)差異的前16種藥物。發(fā)現(xiàn)APOD的表達(dá)與維莫非尼、pd-98059、達(dá)拉非尼、次托霉素、賽魯米替尼、巴非替尼、地尼羅星diftitox ontak和cobimetinib（異構(gòu)體1）的敏感性呈正相關(guān)，它表明APOD的表達(dá)水平越高，對上述藥物的敏感性越大，但APOD與吡唑吖啶、巴特林、多西他賽和普拉唑酸呈負(fù)相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)APOH的表達(dá)與艾司洛爾的敏感性高度相關(guān)，INHA的表達(dá)被發(fā)現(xiàn)與氟維司群的敏感性密切相關(guān)，但與氨酚烷胺的敏感性成反比。此外，STAD患者中GLP2R的表達(dá)越高，患者對地西他濱的敏感性越高（圖12A）。為了進(jìn)一步提高腫瘤突變負(fù)擔(dān)相關(guān)預(yù)后模型對胃癌治療的臨床價值。分析了臨床治療胃癌的常用藥物，其中包括順鉑、多柔比星、吉西他濱、拉帕替尼，發(fā)現(xiàn)吉西他濱在高危組比低危組更敏感，而拉帕替尼則相反（圖12B-E）。
05 - GLP2R的下調(diào)抑制STAD細(xì)胞的增殖和遷移
????????為了評估GLP2R在胃癌中的具體作用，作者分析了GLP2R在八個胃癌細(xì)胞系（GES1、BGC-823、MKN45、SNU-216、SGC-7901、MGC-803、AGS和N87）的相對mRNA表達(dá)水平。GLP2R在BGC-823和MKN45細(xì)胞系中的表達(dá)水平高于其他細(xì)胞系（圖13A）。首先通過qRT-PCR和Western blot評估了細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)在siRNA 3轉(zhuǎn)染后，GLP2R的相對表達(dá)水平明顯降低（圖13B，C）。為了進(jìn)一步證實GLP2R在增殖中的作用，進(jìn)行了CCK-8實驗來檢測GLP2R敲除的效果。GLP2R沉默后，BGC-823、MKN45細(xì)胞的增殖與對照組細(xì)胞相比明顯下降（圖13D）。菌落形成實驗也表明，GLP2R沉默明顯抑制了BGC-823細(xì)胞的生長（補(bǔ)充圖S4A-B）。進(jìn)行了轉(zhuǎn)孔和傷口愈合實驗來檢測遷移，結(jié)果顯示，用siRNA轉(zhuǎn)染的BGC-823、MKN45細(xì)胞的遷移率明顯低于對照組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（圖13E-H）。這些數(shù)據(jù)表明，GLP2R敲除抑制了BGC-823, MKN45細(xì)胞的增殖和遷移能力。
四、結(jié)論
????????本研究結(jié)果意味著高TMB的STAD患者有更好的預(yù)后。利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的STAD樣本鑒定了高和低TMB組之間的DEGs，并研究了免疫細(xì)胞浸潤特征與TMB之間的關(guān)系。此外，利用一系列的生物信息學(xué)方法建立了免疫預(yù)后模型，并進(jìn)行了多次驗證。通過建立動態(tài)提名圖App在線和基于預(yù)后模型的免疫治療預(yù)測，進(jìn)一步加強(qiáng)了臨床轉(zhuǎn)化的重要性。最后，GLP2R可望成為胃癌的一個潛在靶點。
