通訊作者：
這篇文章給我的感覺跟內(nèi)毒素血癥中肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄改變引起巨噬細(xì)胞招募和T細(xì)胞抑制有點像，都是做的細(xì)胞間的互相調(diào)控。
1. Reverse correlation between survival and fibrosis- inflammation in human patients with PDAC
Fig 1A： 多種染色結(jié)果提示PDAC腫瘤中存在大量CAF。而且這些PDAC-CAFs是PDGFRα和PDGFRβ陽性的。而且和周圍正常組織相比，PDGFRα和PDGFRβ升高了十倍以上。為了區(qū)分inflammatory CAFs (iCAFs)和myofibroblastic CAFs (myoCAFs)，作者還對IL-6 和 α-SMA 進行了染色。結(jié)果提示PDAC組織中主要是myoCAFs，而IL-6+ iCAFs很少。
Fig 1B： 對20例PDAC和20例對照組織的qpcr結(jié)果也顯示PDAC組織中PDGFRB水平增高。
Fig 1C-E： TCGA數(shù)據(jù)庫中和正常胰腺相比，人PDAC組織的PDGFRB, FAP 和 PDPN都顯著升高。
Fig 1F-H： 除了纖維化，PDAC組織中還存在著大量的CD163+巨噬。
Taken together, these findings show that human PDAC tumours contain high fibrotic and inflammatory components, which correlate with poor survival.
2. Specific upregulation of IL-33 in human PDAC and its correlation with inflammation
Fig 2A： 為了確定誘導(dǎo)PDAC炎癥的潛在分子或細(xì)胞因子，作者進行了一個inflammatory profiling qPCR array。結(jié)果顯示IL33出現(xiàn)了最顯著的上調(diào)。
Fig 2B-D： qpcr、elisa和TCGA的結(jié)果都提示PDAC組織中IL33的上調(diào)。
Fig 2E： 免疫熒光結(jié)果提示IL33主要來自IL-6+ iCAFs。
Fig 2F： IL33的受體ST2主要在炎性單核/巨噬細(xì)胞表達同時也有一小部分在成纖維細(xì)胞中表達。
Fig 2G： 在小鼠腫瘤模型中，St2主要表達于freshly isolated F4/80+ TAMs。
Fig 2H： 同樣的，在20例PDAC組織中CD163+ TAMs主要是ST2+的。
Fig 2I-J： 不管是TCGA還是作者自己的數(shù)據(jù)都顯示IL33和CD163存在顯著相關(guān)性。
Fig 2K-L： 對人和小鼠多種腫瘤組織的檢測提示IL33在PDAC中特異性表達。
Together, PDAC stromal fibroblasts produce high levels of IL-33, which correlates with TAMs infiltration.
3. IL-33-induced TAM-CXCL3 production reversely correlates with patient survival
Fig 3A： 作者使用IL33干預(yù)了小鼠巨噬細(xì)胞，進行了RNAseq分析。結(jié)果提示存在Cxcl3的顯著上調(diào)。
Fig 3B： 在人的組織 qPCR array中，CXCL3也是最顯著上調(diào)的基因之一。
Fig 3C-D： qpcr和western驗證了IL33刺激后CXCL3的上調(diào)。
Fig 3E： 為了研究TAM中L-33–ST2-依賴的CXCL3上調(diào)，作者構(gòu)建了St2-/- (ST2 KO)鼠。并在St2-/- 鼠上種植了Panc02胰腺癌細(xì)胞。種植2w后，作者切除了腫瘤，分離了其中的F4/80+ TAMs，進行了Affymetrix microarray analysis。
Fig 3F： 結(jié)果顯示敲除ST2后，TAM的CXCL3表達下降。
Fig 3G： si掉巨噬細(xì)胞的St2再加Il33干預(yù)，Cxcl3水平顯著下降，也提示了Cxcl3的表達是Il33依賴的。
Fig 3H, I： TCGA和作者自測數(shù)據(jù)都提示CXCL3和IL33的表達具有很強正相關(guān)。
Fig 3J： TCGA數(shù)據(jù)中PDAC的CXCL3表達也顯著高于正常胰腺。
Fig 3K, L： 作者對20例PDAC和20例對照的qpcr和western也提示PDAC組織的CXCL3顯著更高。
Fig 3M： CXCL3水平與PDAC患者更差的DFS相關(guān)。
Fig 3N： 免疫熒光的結(jié)果提示CXCL3的表達與CD163+TAM共定位。
These findings show that activation of the IL-33–ST2 in PDAC–M2-TAMs leads to the high production of CXCL3.
4. MYC-dependent mechanism of CXCL3 upregulation by IL-33
隨后作者探究了IL33誘導(dǎo)CXCL3上調(diào)的機制。因此作者對IL-33刺激后的巨噬細(xì)胞的通路進行了分析。
Fig 4A： 作者發(fā)現(xiàn)IL33誘導(dǎo)后存在mitogen-activated protein kinases extracellular signal-regulated kinase (ERK)和p38的活化。
Fig 4B： 為了探究這些分子活化和CXCL3表達的關(guān)系，作者使用了ERK inhibitor U0126 和 p38 inhibitor SB203580，發(fā)現(xiàn)它們可以阻斷IL33誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達CXCL3。
Fig 4C： 和分離自PDAC的F4/80-細(xì)胞相比，TAMF4/80+細(xì)胞顯著高表達Cxcl3， 而且這個表達可以被TAMU0126和SB203580抑制。
These results showed that the F4/80+ monocytes / macrophages were primarily responsible for Cxcl3 production via ERK-mediated and p38-mediated regulatory mechanisms.
為了探究轉(zhuǎn)錄調(diào)控，作者employed a transcriptome approach to define transcription factors. （翻譯組呢？沒有看到數(shù)據(jù)?。?br>
Fig 4D： 鑒定出Myc是最顯著上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子之一。
Fig 4E： qpcr證實了IL33誘導(dǎo)的Myc的上調(diào)，而且這個上調(diào)是RK-dependent 和 p38- dependent。
Fig 4F： 在F4/80+巨噬上也得到了一樣的結(jié)果。
Fig 4G-H： Myc的siRNA和抑制劑10058-F4都阻斷了IL33誘導(dǎo)的Cxcl3的上調(diào)。
These findings show a MYC-dependent mechanism of IL-33-induced Cxcl3 production.
Fig 4I： 對Cxcl3 promoter區(qū)的分析提示在?225 to ?220 bp存在Myc的binding motif。
Fig 4J： Chip驗證了MYC和Cxcl3 promoter區(qū)的直接結(jié)合。
Fig 4K： These findings uncover a novel IL-33–ST2–ERK/ p38–MYC-CXCL3 mechanism of CXCL3 production in macrophages
到這里，PDAC中TAM高表達CXCL3的機制就做完了。
由于CXCL3是一個分泌型趨化因子，作者接下來探究了CXCL3的受體CXCR2的表達，也就是開始做細(xì)胞互作。
5. Specific expression of CXCL3 in PDAC and its receptor CXCR2 in fibrotic cells
Fig 5A： 基于前面打的研究，作者假設(shè)IL-33–ST2–ERK/p38–MYC是CXCL3產(chǎn)生的關(guān)鍵pathway，而CXCL3應(yīng)該是胰腺癌特異性表達的。因此作者在TCGA數(shù)據(jù)庫中分析了多種腫瘤CXCL3的表達，發(fā)現(xiàn)PDAC是表達CXCL3最高的腫瘤之一。
Fig 5B： 對小鼠腫瘤的分析也得到了一致的結(jié)果。
隨后作者探究了CXCL3的受體-CXCR2的表達。
Fig 5C-D： 發(fā)現(xiàn)在多種細(xì)胞系中，CXCR2在成纖維細(xì)胞中表達最高。更重要的是，PDAC腫瘤細(xì)胞(Panc02)中的CXCR2表達也很低。這些結(jié)果提示TAM表達的CXCL3可能通過CXCR2調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞，而不是腫瘤實質(zhì)細(xì)胞。
Fig 5E： 使用Panc02和額外兩種PDAC細(xì)胞系(K158和K399)染色結(jié)果同樣提示腫瘤組織明顯高表達CXCL3和CXCR2，且CXCL3主要是TAM表達，而CXCR2主要是α-SMA+ myoCAFs表達，而不是IL-6+ iCAFs。
Collectively, these three independent PDAC tumours show a general pattern of the stroma-derived CXCL3 and CXCR2 in altering TME in PDAC.
Fig 5F： 為了探究CXCR2表達和IL33信號通路的關(guān)系，作者對PDAC進行了藥物阻斷和敲除ST2的處理。使用sST2干預(yù)和敲除都降低了PDAC腫瘤組織中CXCR2和PDGFRβ的表達。
Fig 5G-H： 同樣自測數(shù)據(jù)和TCGA都顯示PDAC中CXCR2顯著升高。
Fig 5I-L： 在人PDAC腫瘤組織中，CXCR2的表達和PDGFRB, FAP, PDPN顯著相關(guān)。
Fig 5M： 小鼠PDAC腫瘤組織中，PDGFRβ 和 CXCR2 也存在顯著共定位。而且和周圍正常組織相比，PDAC中CXCR2的表達升高了接近20倍。
These data support the fact that CXCR2 is mainly expressed in PDAC-CAFs.
6. Activation of the CXCL3–CXCR2 confers the fibroblast-to- myofibroblast transition
找到CAF表達CXCR2之后，就是看CXCR2活化之后對CAF的影響了
Fig 6A-B： 隨后作者分離了原代小鼠成纖維，使用CXCL3做體外干預(yù)后送了RNA-seq。結(jié)果顯示Acta2被顯著激活。同時Il6表達下降，提示CAF炎性下降，但向肌成纖維分化增加。
Fig 6C-E： qpcr驗證了CXCL3刺激后肌成纖維marker (Acta2以及desmin, vimentin)的表達上調(diào)。提示myofibrotic transition是CXCR2依賴的。
Fig 6F： 鬼筆環(huán)肽染色提示CXCL3刺激的成纖維呈spindle-like形態(tài)，并存在overt actin fibres。此外，membrane ruffling結(jié)構(gòu)的存在提示細(xì)胞存在high motility。而si掉Cxcr2后這種形態(tài)改變則消失，提示這些形態(tài)轉(zhuǎn)變是Cxcr2依賴的。
Fig 6G： CXCL3刺激對增殖沒有影響。
Fig 6H, I： 相反的，CXCL3顯著刺激了成纖維的motility，而這個過程也是CXCR2依賴的。
These results indicate that activation of CXCR2 by CXCL3 leads to the fibroblast-to- myofibroblast transition (FMT), which significantly contributes to fibroblast migration.
7. Causative link between ST2 and CXCR2 signalling in FMT
Fig 6J-K： 對CXCL3干預(yù)的成纖維RNAseq數(shù)據(jù)中的migration and metastasis-related genes進行分析提示α-SMA (Acta2)是最顯著高表達的基因，出現(xiàn)非常顯著的高表達。
Fig 6L： small GTP-binding protein Rac在CXCL3-stimulated成纖維中也顯著高表達。
Fig 6M： 在小鼠PDAC組織中，aSMA也出現(xiàn)了顯著高表達（和肺癌相比，為什么不是和癌旁組織相比）。
Fig 6N： 給sST2或敲掉ST2同樣阻斷了PDAC中aSMA的表達。
Fig 6O-R： ACTA2在PDAC中高表達，與CXCL3表達呈正相關(guān)，且與患者預(yù)后相關(guān)。
8. CXCL3-primed myofibroblasts promote cancer metastasis
做了成纖維向肌成纖維轉(zhuǎn)化之后，下一步就是看這個成纖維表型對腫瘤的影響（成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)）
Fig 7A-B： CXCL3-primed 肌成纖維對Panc02胰腺癌細(xì)胞的增殖沒有影響，但顯著促進了細(xì)胞的motility。（條件培養(yǎng)基）
Fig 7C-D： 接下來作者直接做了共培養(yǎng)。同樣的，肌成纖維和PDAC形成了cluster，而且CXCL3進一步增強了細(xì)胞cluster的形成。
Fig 7E-F： Gene expression profiling analysis提示collagen III 是CXCL3刺激的成纖維細(xì)胞上調(diào)最顯著的粘附相關(guān)基因。
Fig 7G： si掉Col3a1則消除了cluster形成，說明這個現(xiàn)象是Col3a1依賴的。
Fig 7H： 此外，wound assay也提示silencing Clo3a1可以完全阻斷CXCL3-MS5刺激的Panc02 motility。
These data suggest a CXCL3–CXCR2–type III collagen axis in governing the physical interaction between myofibroblasts and pancreatic cancer cells.
9. ST2–TAM–CXCR2-dependent PDAC metastasis
基本結(jié)論都有了，最后一part該往臨床上靠了
Fig 8A： 為了探究這個發(fā)現(xiàn)的clinical relevance，作者develop了一個PDAC metastasis model。作者對Panc02荷瘤小鼠使用氯膦酸鹽脂質(zhì)體清除了巨噬細(xì)胞。與預(yù)期一致，在清除掉TAM之后，CXCL3和aSMA在腫瘤組織中的表達顯著下降。
Fig 8B： 氯膦酸鹽脂質(zhì)體處理顯著減少了metastatic nodules的數(shù)量。
Fig 8C-D： 同樣的，使用藥物或敲除st2來抑制IL33也得到了一致的結(jié)果。
Fig 8E-G： 在患者中，PDAC通常通過門靜脈進行肝轉(zhuǎn)移。為了復(fù)現(xiàn)這個臨床表現(xiàn)，作者通過門靜脈自發(fā)轉(zhuǎn)移建立了clinically relevant metastatic model。在這個模型中，使用CXCR2特異性的inhibitor SB225002顯著降低了aSMA的表達、TAM的招募荷CXCL3的表達。
Fig 8H-I： SB225002也顯著降低肝轉(zhuǎn)移。
Fig 8J-M： 為了進一步驗證上面的結(jié)論，作者使用了另外2個PDAC腫瘤模型來進行自發(fā)轉(zhuǎn)移實驗。對518 和 K399 荷瘤小鼠給予S225002治療顯著降低了肺轉(zhuǎn)移。
Taken together, these data demonstrate that the ST2–TAMs–CXCL3–CXCR2 axis is a crucial signalling pathway in promoting PDAC metastasis.
10. Disruption of integrin β-1 inhibits PDAC metastasis
Fig 8N： 已知整合素α1β1 和 α2β1 介導(dǎo)了和col3的互作，因此作者在Pac02 PDAC轉(zhuǎn)移中阻斷β1整合素 (使用shRNA) 的作用。結(jié)果顯示knock down of β1 integrin 顯著降低了PDAC的轉(zhuǎn)移。
These findings show that the β1 integrin is crucial for mediating the collagen III-integrin interaction and metastasis.
