一、預(yù)測(cè)MT原蛋白結(jié)構(gòu)
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訪問(wèn)AlphaFold3官網(wǎng)：打開(kāi)網(wǎng)址https://alphafoldserver.com/。
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輸入蛋白序列：在上圖中紅框所框出的位置中輸入CAX1原蛋白序列。
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提交預(yù)測(cè)任務(wù)：輸入完成后點(diǎn)擊“Continue and preview job”，然后在彈出的對(duì)話框中選擇“Confirm and submit job”。系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。
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4.運(yùn)行結(jié)束，點(diǎn)擊樣品前√就可以查看預(yù)測(cè)結(jié)果
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查看預(yù)測(cè)結(jié)果：預(yù)測(cè)完成后，可以點(diǎn)擊查看預(yù)測(cè)結(jié)果?？梢钥吹絧TM為0.49，整體結(jié)構(gòu)可信度還可以。
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下載結(jié)果：點(diǎn)擊頂部的“Download”下載。最終可以得到如下文件，為了便于后面的比較，我們將fold_cax1_model_0重命名為MT.cif
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二、預(yù)測(cè)CAX1磷酸化修飾結(jié)構(gòu)
- 選擇修飾：輸入CAX1原蛋白序列后，點(diǎn)擊“+PTMs”
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在彈出的界面中選中想要選擇修飾的氨基酸，例如38-41位的S
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然后下拉可以看到選擇修飾的界面，選擇“Phosphoserine”
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全部選擇完畢后，點(diǎn)擊“Save”，此時(shí)可以看到序列下方出現(xiàn)PTMs一欄。
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同時(shí)網(wǎng)頁(yè)版也給出其他可選擇的修飾類型，例如我們?cè)谶@里選擇K
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下拉后可以看到有一系列修飾類型：
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- 預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)：按照前面所示操作預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)后，我們可以得到如下結(jié)果
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- 下載結(jié)果：點(diǎn)擊頂部的“Download”下載。最終可以得到如下文件，為了便于后面的比較，我們將fold_cax1_phos_model_0重命名為CAX1_phos。
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?? PyMOL結(jié)構(gòu)比對(duì)
- 打開(kāi)CAX1原結(jié)構(gòu)：點(diǎn)擊“File-Open”，打開(kāi)前面所展示的CAX1結(jié)構(gòu)文件
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- 打開(kāi)CAX1翻譯后修飾結(jié)構(gòu)：點(diǎn)擊“File-Open”，打開(kāi)前面所展示的CAX1_phos結(jié)構(gòu)文件
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- 蛋白結(jié)構(gòu)比對(duì)：在命令框中輸入如下比對(duì)命令，
align MT,WT
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從上圖看到比對(duì)的整體情況，可以看到二者結(jié)構(gòu)比較類似。同時(shí)軟件給出RMSD值，由此可判斷二者的結(jié)構(gòu)存在區(qū)別。
- 展示氨基酸序列：點(diǎn)擊“Display-Sequence”，展示兩個(gè)蛋白的氨基酸序列。在這里我們可以看到CAX1中38-41位為S；CAX1_phos中38-41位為SEP，表示S發(fā)生磷酸化修飾
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- 放大點(diǎn)突位置：為了便于比較二者的結(jié)構(gòu)，我們首先用鼠標(biāo)選中兩個(gè)蛋白在38-41位的氨基酸，此時(shí)可看到右側(cè)出現(xiàn)“（sele）”一欄
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然后調(diào)整界面，放大發(fā)生修飾的氨基酸所在的位置，使其處于中央界面
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- 調(diào)整氨基酸顏色：首先用鼠標(biāo)選中CAX1在38-41位的SSSS氨基酸，然后在“（sele）”一欄中左擊“C”，選擇“magentas- magenta”
[圖片上傳失敗...(image-2660b4-1758779887880)] 然后用鼠標(biāo)選中CAX1_phos在38-41位的SEP SEP SEP SEP氨基酸，然后在“（sele）”一欄中左擊“C”，選擇“reds-red”[圖片上傳失敗...(image-e79a1e-1758779887880)]
最終可以看到發(fā)生磷酸化修飾和不發(fā)生修飾的氨基酸發(fā)生顏色變化，以及對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)變化。
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- 比較結(jié)構(gòu)變化：從下面這張圖中我們可以看到38-41位的S發(fā)生磷酸化修飾后α-helix位置發(fā)生了相對(duì)位移。而這種結(jié)構(gòu)位移對(duì)CAX1結(jié)合離子起到重要的作用。
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參考文獻(xiàn)：
Wang C, et al., Mechanisms of calcium homeostasis orchestrate plant growth and immunity. Nature. 2024
