1、mapping（bowtie2）比對(duì)，估計(jì)基因豐度

2、利用contig的核酸組成和豐度的算法來(lái)binning，之后再進(jìn)行單菌組裝、宏基因組關(guān)聯(lián)分析等

Mapping簡(jiǎn)介：

序列的兩種分析策略：read-based (mapping) 和 assembly-based

assembly-based approach 受到覆蓋度的制約，因?yàn)榻M裝時(shí)低覆蓋度的區(qū)域是不會(huì)進(jìn)行組裝的，而是被丟棄，這樣低豐度的細(xì)菌的信息就被丟棄了，反映在reads利用率上，就是往往reads利用率極低，往往低于50%

而 read-based (mapping) approach 則受到reference databases的制約，因?yàn)榧?xì)菌的遺傳多樣性很高，即便是同一個(gè)菌種，它的不同菌株，其基因組的組成也是有相對(duì)比較大的差異的，那么在mapping的時(shí)候就會(huì)出現(xiàn)mapping不上的問(wèn)題，使得mapping效率不夠高；而且只能分析reference databases中有的物種，對(duì)于reference databases未收錄的新物種，是無(wú)法進(jìn)行分析的。

binning簡(jiǎn)介：

宏基因組分箱（Binning）是將宏基因組測(cè)序得到的混合了不同生物的序列或序列組裝得到的contigs按物種分開(kāi)歸類(lèi)的過(guò)程。聚類(lèi)技術(shù)知識(shí)盡力去通過(guò)識(shí)別reads或contigs特殊的地方以及跟其他序列相近的地方來(lái)分出OUT的分類(lèi)。

宏基因組分箱有助于獲得某些微生物的全基因組序列，獲得新物種的基因組序列和功能，預(yù)測(cè)未知物種的培養(yǎng)方法等等。

基于宏基因組數(shù)據(jù)的contig binning分析，可基于宏基因組組裝結(jié)果，將組成相似以及豐度分布模式一致的contig劃分到同一物種，并進(jìn)一步進(jìn)行單菌的草圖組裝。從而可在基于單菌組裝結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行菌株水平的基因和功能注釋、比較基因組分析、進(jìn)化分析等。

binning原理：

1、最開(kāi)始進(jìn)行binning分析的依據(jù)是，來(lái)自同一菌株的序列，其核酸組成是相似的。于是可以根據(jù)核酸組成信息來(lái)進(jìn)行binning，例如根據(jù)核酸使用頻率（oligonucleotide frequency variations），通常是四核苷酸頻率（tetranucleotide frequency）、GC含量和必需的單拷貝基因等。即根據(jù)核酸組成（NC-Nucleotide composition）來(lái)進(jìn)行contig binning。

2、隨后的研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自同一個(gè)菌株的基因在不同的樣品中 ( 不同時(shí)間或不同病理程度 ) 的豐度分布模式是相似的 (Nielsen et al., 2014)。因此可以根據(jù)基因在不同樣品中的豐度變化模式（ co-abundance patterns across multiple samples），即微分豐度（DA-Differential abundance）來(lái)進(jìn)行contig binning。這種方法更有普適性，一般效果也比較好，能達(dá)到菌株的水平。但這種方式需要較大樣本量，一般至少要50個(gè)樣本以上，且至少要有2個(gè)組能呈現(xiàn)豐度變化 ( 即不同的處理、不同的時(shí)間、疾病和健康、或者不同的采樣地點(diǎn)等 ) ，每個(gè)組內(nèi)的生物學(xué)重復(fù)也要盡量的多。

3、還可以同時(shí)依據(jù)核酸組成和豐度變化信息，即核酸組成與豐度（NCA-Nucleotide composition and abundance），利用核酸組成信息和豐度差異綜合計(jì)算距離矩陣，既能保證binning效果，也能相對(duì)節(jié)約計(jì)算資源，現(xiàn)在比較主流的binning軟件大多是NCA算法。

總結(jié)：Microbiome期刊于2016年發(fā)表了一篇綜述，認(rèn)為contig binning的組裝策略主要分為3類(lèi)：核酸組成（NC）、微分豐度（DA）、核酸組成與豐度（NCA）等，然而各個(gè)方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)(Sangwan et al., 2016)[9]。

核酸組成與豐度（NCA）算法將核酸組成信息和豐度差異信息創(chuàng)建一個(gè)綜合的距離矩陣，既能保證binning效果，也能相對(duì)節(jié)約計(jì)算資源。

針對(duì)宏基因組測(cè)序后的數(shù)據(jù)不同聚類(lèi)方法的前提，方法，優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)和挑戰(zhàn)：

http://blog.sina.com.cn/s/blog_50e7795c0102wm7s.html

應(yīng)用：宏基因組關(guān)聯(lián)分析（MWAS-Metagenome Wide-Association Study）以及單菌組裝。

一、宏基因組關(guān)聯(lián)分析流程，常見(jiàn)關(guān)聯(lián)分析方法：

多元統(tǒng)計(jì)分析：例如根據(jù)PERMANOVA分析，識(shí)別和分組顯著相關(guān)的因素（例如藥物干預(yù)或者疾?。?/p>

非監(jiān)督模型聚類(lèi)分析： 如腸型分析；

差異檢驗(yàn)：根據(jù)差異檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)算法，識(shí)別組間差異物種或差異基因；

功能分析： 識(shí)別和疾病等相關(guān)的通路或者功能；

分類(lèi)模型構(gòu)建： 例如使用決策樹(shù)算法或者分類(lèi)算法，對(duì)分類(lèi)模型構(gòu)建并評(píng)估。

二、單菌組裝流程：

1、得到bins后的組裝。將各個(gè)樣品的clean reads分別同該bin所包含的contigs進(jìn)行比對(duì)，并計(jì)算每個(gè)樣品map上的比例，選取map率高的前幾個(gè)樣品map上的reads分別單獨(dú)組裝，同時(shí)也可以將map率高的這幾個(gè)樣品中map上的reads混合在一起進(jìn)行組裝，可選取組裝效果好的做為最終組裝結(jié)果。對(duì)于組裝軟件，可使用常用的組裝軟件SOAPdenovo、Velvet、ABySS、Spades 等。

2、組裝效果評(píng)估。對(duì)于上述bins重新組裝得到的基因組草圖，可以進(jìn)行基因組完整度的評(píng)估，也可以用CheckM和GC-Depth分布圖，來(lái)評(píng)估組裝效果。

3、 組裝的單菌基因組分析。對(duì)組裝后的基因組草圖，可進(jìn)一步進(jìn)行單菌組裝出的基因組分析，包括基因組組分分析、基因預(yù)測(cè)以及功能注釋分析、共線(xiàn)性比較分析等。如果需要對(duì)組裝出來(lái)的單菌進(jìn)行注釋?zhuān)梢曰贜R庫(kù)。后續(xù)可進(jìn)行ANI（ average nucleotide identity ）等分析。種內(nèi)菌株的精細(xì)化鑒定還可以借助系統(tǒng)發(fā)育分析，比較基因組分析等方法。由于組裝出來(lái)的基因組草圖很可能是未知的物種，在NCBI中并沒(méi)有近緣相關(guān)的參考基因組，或者bin的基因組草圖組裝的太碎，都可能導(dǎo)致物種鑒定達(dá)不到理想的效果。

pipeline

1、比對(duì)估計(jì)基因豐度的軟件：

bowtie2、samtools、bedtools

2、binning軟件（Maxbin、MetaBAT、MetaWatt、CONCOCT、MyCC）

安裝方式（maxbin為例）：

curl ?https://downloads.jbei.org/data/microbial_communities/MaxBin/getfile.php?MaxBin-2.2.2.tar.gz > MaxBin-2.2.2.tar.gz

tar xzvf MaxBin-2.2.2.tar.gz

cd MaxBin-2.2.2/src

make

添加環(huán)境變量

curl -L https://bitbucket.org/berkeleylab/metabat/downloads/metabat-static-binary-linux-x64_v0.32.4.tar.gz > metabatv0.32.4.tar.gz

tar xvf metabatv0.32.4.tar.gz

3、分箱后評(píng)估的軟件checkm：

conda create -n checkm checkm=1.0.11 ? #安裝checkm

4、分箱后可視化軟件vizbin：

5、估計(jì)物種豐度的軟件Metaphlan、Karken

安裝方式（Metaphlan）

wget https://bitbucket.org/biobakery/metaphlan2/get/default.zip

tar xzvf biobakery-metaphlan2-<versioned>.tar.gz

cd biobakery-metaphlan2-<versioned>/

添加環(huán)境變量

Karken

conda create -n kraken=1.0

karken db 下載 wget -c https://ccb.jhu.edu/software/kraken/dl/minikraken_20171019_8GB.tgz

6、組裝和分箱結(jié)果的可視化：Anvio

安裝方式conda create -n anvio anvio=4.0.0

7、數(shù)據(jù)庫(kù)

## eggnog對(duì)應(yīng)的細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)下載

download_eggnog_data.py bact

## silva 原核和真核微生物的小亞基rRNA基因序列（簡(jiǎn)稱(chēng)SSU，即16S和18SrRNA)

axel https://www.arb-silva.de/fileadmin/silva_databases/release_128/Exports/SILVA_128_SSURef_Nr99_tax_silva_trunc.fasta.gz

## nr非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)

# 結(jié)合diamond進(jìn)行nr庫(kù)比對(duì)

axel ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/FASTA/nr.gz

axel ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/FASTA/nr.gz.md5

# https://github.com/bbuchfink/diamond

# diamond makedb --in nr.faa -d nr

## MEGAN注釋文件

wget http://ab.inf.uni-tuebingen.de/data/software/megan6/download/prot_acc2tax-Mar2018X1.abin.zip

wget http://ab.inf.uni-tuebingen.de/data/software/megan6/download/SSURef_NR99_128_tax_silva_to_NCBI_synonyms.map.gz

## kaiju物種注釋文件

# Representative genomes from proGenomes

makeDB.sh -p -v

# Non-redundant protein database nr

makeDB.sh -n

##karken 注釋文件

kraken2-build --standard --threads 24 --db kraken

?

參考：

https://blog.csdn.net/woodcorpse/article/details/78483295

http://www.itdecent.cn/p/d80e331de68a

http://blog.sina.com.cn/s/blog_50e7795c0102wm7s.html

http://www.itdecent.cn/p/66ab14988a74

https://www.sohu.com/a/227023939_464200

http://wap.sciencenet.cn/blog-3334560-1128063.html

https://blog.csdn.net/wangyiqi806643897/article/details/25231113

bowtie2 manual網(wǎng)址：http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml