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1. 作者介紹
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作者介紹1
本文的作者是四川農(nóng)業(yè)大學的園藝學院的博士，由于是我們課題組的，因此有一點自吹自擂的嫌疑。該文刊登的期刊影響因子2~3，不算頂級期刊。
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作者介紹2
本文發(fā)表時間為2018年，引用次數(shù)少，然而為什么要解析這篇文章主要有兩個原因。首先是因為這篇文章為我們實驗室的文章，因此比較了解相關的研究方法，分析起來比較得心應手。其次，由于此類文章是近幾年的一類常見的文章，并且實驗技術不算豐富然而卻有很多期刊接收此類文章，因此這種套路文章的適當發(fā)表對于畢業(yè)和升學比較有意義。
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2. 全文翻譯
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摘要
摘要
背景：
草莓由于它的營養(yǎng)價值、獨特的香味和誘人的外觀已經(jīng)獲得了大量的關注。全基因組測序以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的建立為系統(tǒng)地研究基因功能提供可能。目標基因表達數(shù)據(jù)為了解其生物學功能提供了線索。實時定量PCR（RT-qPCR）是快速研究基因功能的良好方法。這個方法需要穩(wěn)定表達的參考基因（reference gene）來均一化數(shù)據(jù)從而得到精確可靠的數(shù)據(jù)結(jié)果。
結(jié)果：
在此研究中，我們采用了3種數(shù)據(jù)算法（geNorm、NormFinder and BestKeeper）分別檢測了個候選基因在不同組織和果實大于時期以及不同光質(zhì)處理下（plant subjected to ... treatment ）和低溫處理下的基因表達穩(wěn)定性。結(jié)果表明在不同實驗環(huán)境下的基因參考基因表達均有變化（這個是第一個結(jié)果， varied under different treatments ）?？傮w來講，DBP，HISTH4，ACTIN1和GAPDH表達更為穩(wěn)定，而PIRUV，ACTIN2和18S在我們的實驗中不作為推薦的參考基因因為其較低的穩(wěn)定性（due to）（這個是第二個結(jié)果）。此外，相關的基因HY5表達模式被用來確認參考基因的可靠性（驗證結(jié)果），從而證明了在定量PCR中正確選擇內(nèi)穿基因的重要性（was of great importance)
結(jié)論：
草莓內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性（expression stability）在我們選擇的實驗條件下具有差異性（varied across）。對內(nèi)參基因的系統(tǒng)性研究應該優(yōu)先于研究目標基因表達水平以此來提供一個精確的均一化結(jié)果。
前言
前言1
在信號轉(zhuǎn)導以及代謝機制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡的研究中，對基因表達的研究反應目標基因的mRNA豐度和轉(zhuǎn)錄水平，進而為基因功能提供思路。RT-qPCR具有快速、特意和敏感以及重現(xiàn)性（reducibility）已經(jīng)成為確定基因表達以及核實高通量數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠方式。
前言2
然而，RT-qPCR的精確性依賴于許多的變異，包括mRNA的模版質(zhì)量和含量、引物擴增效率、樣品的基因型以及不同的組織和發(fā)育過程、不同生物或非生物脅迫等。因此，一個基本的先決條件（prerequisite）就是均一化過程來減少這些差異。目前最通用的作為qPCR的均一化方法是運用參考基因，但是采用不合適的（inappropriate）參考基因可能造成顯著地數(shù)據(jù)差異和誤差。最終造成不精確甚至是錯誤的結(jié)果（erroneous results）一個理想的參考基因是具有一致的表達量在各種條件并且不能受到實驗參數(shù)的影響。但是，在植物和動物中，并沒有一個通用的參考基因被鑒定出來。許多之前的研究直接選擇傳統(tǒng)的參與基本細胞過程、初級代謝和細胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定相關的基因，如18S染色體（18sRNA）、微管蛋白（tubulin TUB）、泛素化（ubiquitin，UBQ），激動蛋白（actin，ACT）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）來標準目標基因的表達而不評估基因的表達穩(wěn)定（這個有點不明白）。然而，實際上有標明這些參考基因不是一直都可以保持穩(wěn)定的表達在不同的環(huán)境下。此外，一些研究者指出當單一參考基因無法滿足實驗要求的時候兩個或者多個內(nèi)參需要使用。因此選擇和確認參考基因應該在qPCR均一化之前進行。
前言3
草莓是廣受歡迎的果樹作物，并且具有良好的香味口感與質(zhì)地。。尤其是富含有益于人類的營養(yǎng)物質(zhì)如微維生素、礦物質(zhì)與抗氧化物質(zhì)，而這些物質(zhì)近兩年來受到植物育種者、視頻生產(chǎn)者和消費者的關注。這些草莓的特點涉及到許多復雜的代謝過程并受到內(nèi)在和外在因素的調(diào)控影響相關基因的表達。因此對于基因表達的趨勢研究可為揭示關于遺傳背景、脅迫等相關的（regarding）的分子機制提供有用的信息。于是（Accordingly），鑒定穩(wěn)定的參考基因來獲得可靠精確和高精度的基因表達分析數(shù)據(jù)。最近對于草莓參考基因的表達僅僅局限于某些栽培品種和實驗條件下。
前言4
前言5
在本實驗中，選擇了7個候選基因并用qPCR的方式在不同的組織、果實和7個發(fā)育時期以及光質(zhì)處理和冷處理的樣品中進行評估。此外，采用三種不同的數(shù)據(jù)算法包括geNorm、NormFinder和BestKeeper來計算參考基因的穩(wěn)定性從而得到在這些實驗處理中合適的參考基因。
方法材料
方法與材料1
植物材料與處理
‘豐香’草莓品種作為研究候選參考基因表達穩(wěn)定性的材料，栽培與15 cm × 13 cm 的盆中，土壤為營養(yǎng)土、園土和珍珠巖（perlite）以2:2:1（v/v/v)比例混合,并且依照常規(guī)管理（was subjected to rutine management ）在四川農(nóng)業(yè)大學大棚中。特意組織（根，莖，葉，花）以及不同的果實發(fā)育時期（小綠，大綠，白果，轉(zhuǎn)紅，半虹，紅熟，全紅）時期被采集用于評價參考基因。同時，盆栽草莓（portted Strawberry）在白果時期被用于低溫處理（subject to）兩組材料放置于4度（冷處理）和25度（對照）持續(xù)0/6/12/24/48/72小時，光周期為16h白晝（diurnal light ）在 100umol m-2 s-1 和 75% 相對濕度環(huán)境下。
為了篩選穩(wěn)定的參考基因用于均一化草莓在不同光質(zhì)處理中的qPCR的數(shù)據(jù)分析。盆栽草莓（豐香）在花后7天的時候分為4組，放入生長箱中進行處理。處理環(huán)境為8h黑暗 16度，光照16h 25度和75%相對濕度。白色光、紅色光（730nm）、藍色光（450nm）以及紅藍1:1 混合光照LED被放置在培養(yǎng)箱頂部用于光源對草莓苗進行照射100umol m-2 1-s 直到果實成熟。果實在花后14/21/25/28天的時候進行采收。
方法與材料2
總RNA的提取和cDNA首鏈合成（first strand cDNA synthesis）
將采集得到的樣本采用改良的CTAB方法進行總RNA提取 。將質(zhì)量分析后的RNA取1ug采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 參照說明書 （manufacture‘s instruction）進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA。 cDNA稀釋10倍后用于定量PCR反應。
方法與材料3
選擇候選的參考基因以及引物設計和核實
總共7個候選基因用于評估，這些基因基于草莓之前的工作進行選擇包括ACTIN，18S 核糖體RNA （18s RNA），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH），DNA 結(jié)合蛋白 （DBP）和組蛋白H4（histone H4 ,HISTH4),丙酮酸羧化酶（pyruvate decatboxylase， PIRUV）。引物在表一，通過Primer Premier 5.0 軟件或者由參考已發(fā)表的文章進行。qPCR前，每個引物通過在線Primer-Blast 進行檢測其發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體和特異性擴增子長度（amplicon specific-size）。
材料與方法4
采用SYBR Green 進行的 RT-qPCR
RT-qPCR在CFX96 實時PCR系統(tǒng)上進行。所有的反應都采用SYBR Green Primer Ex Taq TM （Takara ，Japan）采用三個技術重復，反應體系為10ul。反應方案采用三步法。熔解曲線放置用于合適引物擴增的特異性（to verify specificity of primer amplification ）。無模版對照在每個反應中用于檢測潛在的試劑污染。此外，對于每個基因，所有的樣品在同樣一個板子中進行用于排除技術變異和板間差異。并采用不同稀釋濃度的cDNA為模版構(gòu)建標準曲線從而計算擴增效率（Amplification efficiency ）和相關系數(shù)（correlation coefficienchy）。
數(shù)據(jù)分析
受試基因的表達水平通過在某一個特定閾值（a specific threshold）的擴增循環(huán)數(shù)進行確定。三種不同的基于Microsoft Excel 的軟件（BestKeeper， goNorm ，NormFinder）用于確定參考基因的表達穩(wěn)定性。BestKeeper分析原始Cq值而得到最低的標準差（standard deviation，SD）而確定最穩(wěn)定的基因。geNorm和Normfinder 通過獲取Cq值進一步轉(zhuǎn)換為相對表達量進行評估。在geNorm 參考基因具有最低配對變異即為最穩(wěn)定的基因，而在NormFinder中，參考基因最穩(wěn)定的到最不穩(wěn)定的基因基于穩(wěn)定值和進行排序，而追最第穩(wěn)定性的為最穩(wěn)定的基因（這個地方有點問題，我需要進一步核實關于算法和結(jié)果分析）
方法與材料5
方法與材料6
驗證參考基因
FaHY5，是一個bZIP轉(zhuǎn)錄因子用于檢測參考基因。該基因參與了植物發(fā)育，信號轉(zhuǎn)導和脅迫響應。引物序列為：（這個就不說了）。選擇在各個處理中最穩(wěn)定的參考基因和最不穩(wěn)定的基因分別作為參考基因以用于計算FaHY5的表達量。
結(jié)果
結(jié)果1
候選基因的擴增特異性和效率（amplification specificity and efficiency）
7個候選基因的特意引物被用于qPCR，擴增長度為72到219bp。6個引物對是采用前面的研究中使用的擴增引物。ACTIN1的引物采用引物涉及軟件Primer Premier 5.0 并且通過PCR產(chǎn)物電泳檢測其擴增產(chǎn)物的單一性。此外，熔解曲線分析單一峰表明所有引物的特異性（Fig 1），同時（meanwhile）無模版對照組中沒有檢測到信號。RT-qPCR擴增效率從86%（18S）～108%（DBP），線性皮爾森相關系數(shù)（R^2）0.990～0.999.
Fig 1
Table 1
結(jié)果2
候選參考基因的表達
定量循環(huán)數(shù)（Cq）在qPCR中被定義為熒光信號達到基線閾值所對應的擴增循環(huán)數(shù)進而用于鑒定基因表達水平的差異。在本研究中，Cq值提供了7個基因的的基因表達水平在三個實驗亞組中，包括不同的組織、不同的果實發(fā)育水平和不同關照處理中。結(jié)果顯示，18S在三個實驗亞組中白哦大量最高，具有最低的平均Cq值（12.37,12.81和13.85）。相反，ACIN2的表達量為最低，具有最高的平均Cq值（with the lowest mean Cq value）在三個實驗亞組中。此外ACTIN2，PIRUV和18S表達出較大的基因表達變異在所有亞組中，根據(jù)箱線圖大小和虛線長度可以得到，然而HISTH4和DBP以及GAPDH變異程度較小并且表達量適中。有趣的是，ACTIN1的Cq值在處理亞組中表達集中（values are intensive)，而在冷脅迫中的表達卻明顯高于其他處理亞組中的Cq值。七個基因的較大的表達量變化（wide expression range ）表明沒有一個參考基因可以在不同的樣本中具有抑制的表達量（constant expression）。因此，在特定的實驗條件下采用可靠的參考近來均一化基因的表達量是非常有必要的（it is of utmost important to）（這個部分可以和文章后面進行一個討論）。
Fig2
候選參考的表達穩(wěn)定性
結(jié)果3
7個候選基因的表達穩(wěn)定性在不同的實驗處理樣本中得到測定和排序，采用的三種不同的計算方法包括NormFinder，geNorm和BestKeeper。
Table2
采用geNorm分析中，根據(jù)平均表達穩(wěn)定性M對基因進行排序。M值基于對后一個基因與其他測試基因的平均配對變異通過連續(xù)排除追捕穩(wěn)定的參考基因。默認的穩(wěn)定值M范圍是<1.5，因此參考基因的M值小則認為是最穩(wěn)定表達的參考基因，反之亦然（and vice varsa）。當把所有來自于不同組織和不同果實發(fā)育時期樣本放在一起分析的時候。DPB和HISTH4的平均表達穩(wěn)定度較低（M=0.96）而PIRUV具有最高的M值，表明DBP和HISTH4是最穩(wěn)定表達的參考基因，PIRUV是最大變異表達的基因。GAPDH和DBP在不同的光照處理下的樣本中同樣表現(xiàn)穩(wěn)定，PIRUV則是穩(wěn)定最差的基因。在低溫處理亞組中（In the subset of sample under low temperrature stress），所有的候選參考基因M值低于1.5可以被選擇為為參考基因，ACTIN1和HISTH4表現(xiàn)的穩(wěn)定性最好，M值也最低?；诮Y(jié)合所有樣本的表達分析顯示DBP和HISTH4具有最穩(wěn)定表達的特性（featured ...)和最打的變異性包括PIRUV和ACTIN2。
結(jié)果4
結(jié)果5
geNorm軟件還可以用于檢測用于跨樣本均一化的最好的參考基因通過在兩個后續(xù)的均一化因子中計算配對變異性（pairwise variation）。一個打的配對變異（推薦的默認值為大于等于0.15）表示加入的基因?qū)换捎陲@著的影響而且應該偏向于包括計算可靠的均一化因子。然而Vn/Vn+1 值低于0.15表明額外的參考基因?qū)τ诰换^程并不是必須的。在我們的研究中，低溫處理亞組中的配對變異V4/V5低于0.15（Fig 3），表明4個基因?qū)τ谀繕嘶虻木换怯斜匾?。而在其他三個實驗亞組中V值都大于0.15，即表明采用多個參考基因可能增加實驗的的不穩(wěn)定性和復雜性。因此一個基因也可以用于實現(xiàn)精確的均一化。
結(jié)果6
結(jié)果 7
參考基因的穩(wěn)定值通過NormFinder算法進行進一步的計算，并基于評估組間（intra）和組內(nèi)（inter）變異和樣品亞組表達水平的分別計算進行排序。NormFinder的分析結(jié)果表明，7個基因的穩(wěn)定排序與geNorm相對一致。GAPDH是最穩(wěn)定的基因具在最初的兩個實驗亞組中，穩(wěn)定值為0.291和 0.251，然而PIRUV和ACTIN2是最不穩(wěn)定的基因。HISTH4基因在低溫和總體中最穩(wěn)定，ACTIN2和18S表達量最為變異，并且在低溫中具有最大的穩(wěn)定值（stability value）為最低穩(wěn)定性的基因。PIRUV和18S在所有的樣品中均為最低穩(wěn)定性的。
Fig 3
結(jié)果8
BestKeeper小程序是基于Excel的工具根據(jù)Cq值的標準差進行評估參考基因的穩(wěn)定性。較低的SD-value表示基因更為穩(wěn)定。BestKeeper排序表明ACTIN1是最穩(wěn)定的參考基因在不同的組織和果實發(fā)育時期的樣本中和低溫處理的樣本中。HISTH4在光質(zhì)處理下表現(xiàn)更好。以及在全部的樣本中，HISTH4也是最好的參考基因。此外，18S、PIRUV和ACTIN2在亞組中表現(xiàn)的總是不穩(wěn)定，這與前面的NormFinder和geNorm所得到的分析結(jié)果是一致的。
結(jié)果 9
結(jié)果10
結(jié)果11
為了驗證在某些實驗中的參考基因可靠性。FaHY5的相對表達量通過兩個最穩(wěn)定和兩個最不穩(wěn)定的基因作為矯正進行計算。在不同的組織中，采用最穩(wěn)定的參考基因FaHY5的表達量在花中表達最高，其次是葉片和根，最后是莖。然而采用最不穩(wěn)定的參考基因會出現(xiàn)明顯的偏差。我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)aHY5表達量在采用所有的參考基因的時候都表現(xiàn)出在著色前高表達的現(xiàn)象。但是最穩(wěn)定的參考基因均一化的結(jié)果表明FaHY5的表達量串聯(lián)變化，而這樣的變化通過最穩(wěn)定的參考基因和最不穩(wěn)定的參考基因進行矯正的結(jié)果有明顯差異（obviously differed）（圖6）。FaHY5表達水平在紅光下受到抑制，當采用GAPDH、DBP、ACTIN2 和 PIRUV作為內(nèi)參基因，如果忽略統(tǒng)計顯著性。在低溫處理下，F(xiàn)aHY5相對表達量均已花結(jié)果采用兩個最為的穩(wěn)定的參考基因進行均一化的時候是一致的。然而采用最差的參考基因18S和ACTIN2的均一化結(jié)果存在很明顯的差異（discrepancies）。這個結(jié)果表明采用穩(wěn)定的參考基因?qū)τ谀繕嘶虻木_均一化具有重要作用。
Fig 4
討論
討論1
===闡明參考基因研究的必要性
基因表達可以更好的解基因功能。qPCR是目前最有效和快速的方法對目標基因的表達進行定量，也可以通過采用可靠的參考基因作為內(nèi)部參考來保證數(shù)據(jù)的可靠性。優(yōu)化的參考基因應該在任何條件下都能保持穩(wěn)定表達。然而這樣的參考基因可能并不存在因為參考已經(jīng)可能在不同的物種、品種、組織和脅迫情況下的表達量會有變化（vary among）。如18S在水稻和病毒侵染的稻谷中穩(wěn)定表達，但是在其他物種中卻表現(xiàn)不好。GAPDH在葡萄和咖啡中表達一致，但是在桃子和小麥中表達不穩(wěn)定。因此，為了保證在特定實驗條件（under certain experimental ）下的結(jié)果準確性，參考基因需要提前驗證。
討論2
===對引物的特異性和擴增效率進行討論
本實驗中，7個參考基因被選中并用于提高在包括不同組織與果實發(fā)育時期和光質(zhì)處理以及低溫處理下的基因表達數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明這些所設計的引物均具有單一熔解曲線峰而均具有良好的特異性（as a single peak）。此外，qPCR對于每一個參考基因均有高的擴增效率。因此表明我們的引物對于分析參考基因的穩(wěn)定性是可靠的。
討論3
討論4
三種算法geNorm、NormFinder和BestKeeper是常用的評估參考基因的軟件。因此，由于不同的數(shù)據(jù)算法和分析流程而造成的評級差異。比如，在不同組織和果實發(fā)育特性中HISTH4，DBP以及ACTIN1在geNorm、NormFinder以及BestKeeper分別評級第一，在光質(zhì)處理中GAPDH是最穩(wěn)定的基因在geNorm、NormFinder兩個軟件，而在BestKeeper中評級為第四（while it was ranked fourth by ...)。 在低溫處理中ACTIN，HISTH4和PIRUV被排在前三在三個子集中，然而ACTIN1和HISTH4在NormFinder軟件分析中交換了位置，HISTH4和PIRUV在果實受到鹽脅迫和干旱脅迫過程中可以作為很好的內(nèi)參基因。然而HISTH4和ACTING在Benzothiadiazole抗性誘導的果實處理中可以作為最好的穩(wěn)定參考基因。表2展示ACING2、PIRUV和18S總是處于最后位置，表明這些基因不適合作為實驗過程中的內(nèi)參基因，這和圖2中的結(jié)果是一致的。在qPCR基因表達的過程中，合適的表達豐度和穩(wěn)定的表達對于選擇參考基因是一個可靠的前提。然而在我們的研究中，ACTIN2，PIRUV和18S在表達量上變異較大。ACTIN2表達量較低，相反18S表達量非常高，而這樣對于表達量中等和較低的目標基因不可靠。這樣的現(xiàn)象在鑒定不同品種以及在氧化脅迫下的研究中同樣有表型，結(jié)論為在所有的測試環(huán)境下最為不穩(wěn)定的基因。之前18S rRNA基因被認為是一個理想的RT-qPCR參考基因，但是最近的研究因為其在許多物種中的高量表達而被排除。因此18S在草莓中不作為合適的參考基因作為推薦。盡管在COA和幾丁質(zhì)處理果實中是一個穩(wěn)定表達。
討論4
HY5，是bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族，正調(diào)控光形態(tài)建成。除了參與植物生長與發(fā)育，HY5 還參與色素積累被認為是多個信號通路的整合點如植物激素、營養(yǎng)以及脅迫。為了基因不驗證我們參考基因的穩(wěn)定性，HY5 基因的表達量通過兩個最好的和最不穩(wěn)定的的基因在每個子集中（一共就是4個）。FaHY5基因的表達量均一化結(jié)果采用穩(wěn)定的參考基因作為內(nèi)參得到的結(jié)果相對一致，然而采用變異性最大的基因作為內(nèi)參的差異很明顯，這也表明正確選擇參考基因?qū)εcqPCR結(jié)果的正確性很重要。
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3. 文章梳理
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前言：
- qPCR的優(yōu)點與廣泛使用。（可以結(jié)合高通量測序結(jié)果的發(fā)展進行）
- qPCR過程中內(nèi)參基因的作用。（羅列一些常用的內(nèi)參基因）
- qPCR的不可通用性。（應用其他工作來證明，也就可以引出在本研究中的必要性）
- 所研究的植物的研究價值和qPCR在這個過程中的作用。（引用相關物種的內(nèi)參選擇文章）
- 本實驗的概括（哪些處理、多少個基因、采用的算法）
