MDC1（Mediator of DNA Damage Checkpoint 1）是DNA損傷應(yīng)答（DDR）通路中的關(guān)鍵支架蛋白，在組蛋白H2AX Ser?139磷酸化（γH2AX）信號放大及下游檢查點(diǎn)激活過程中發(fā)揮核心作用。該抗體A300-051A經(jīng)抗原親和純化，專一識別人類MDC1蛋白第475–525位氨基酸區(qū)域，適用于免疫沉淀（IP）和免疫印跡（WB）。特別是其WB稀釋范圍高達(dá)1:10,000–1:25,000，展示了極高的靈敏度和特異性。本文將從由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗MDC1抗體親和純化抗體（貨號：A300-051A）規(guī)格、免疫原設(shè)計(jì)、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案、分子功能及疑難排除等方面提供完整的技術(shù)參考。
一、產(chǎn)品基本規(guī)格與儲存信息
參數(shù)| 內(nèi)容
靶標(biāo)| MDC1（NFBD1）
反應(yīng)性| 人類
應(yīng)用| IP、WB
宿主/克隆| 兔 / 多克隆
形式| 完整 IgG
免疫原| 位于第475至525位氨基酸之間
亞型| IgG
標(biāo)記物| 未標(biāo)記
純度| 抗原親和純化
抗原種屬|(zhì) 人類
濃度| 1000 μg/ml（1 mg/ml）
保存條件| 2?–?8?°C
有效期| 自收貨之日起 1 年
緩沖液| Tris-檸檬酸/磷酸緩沖液，pH 7–8，含 0.09% 疊氮化鈉
> 關(guān)鍵儲存提示： ?
> - 始終保存于 2–8?°C，切勿冷凍；冷凍會導(dǎo)致抗體聚集和效價衰減。 ?
> - 疊氮化鈉為防腐劑，可能會抑制辣根過氧化物酶（HRP）活性。若計(jì)劃將抗體用于活細(xì)胞成像或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，需通過脫鹽柱或透析去除。 ?
> - 濃度采用比爾定律標(biāo)定（A280?=?1.4 對應(yīng) 1?mg/mL IgG），用戶可根據(jù)此值進(jìn)行精確稀釋。
二、推薦應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)條件
免疫印跡（Western Blot, WB）
推薦稀釋范圍：1:10,000 – 1:25,000（極高稀釋度，充分體現(xiàn)抗體高親和力與低背景） ?
凝膠建議：3?8% Tris?乙酸酯凝膠（Tris?acetate gel），更適合檢測 MDC1 約 220–250?kDa 的大分子量。 ?
封閉液與抗體稀釋液：5% 脫脂牛奶 / TBST ?
一抗孵育：4?°C 過夜（或室溫 2?3 小時，但過夜信號更強(qiáng)） ?
二抗推薦：Goat anti?Rabbit IgG (H+L) HRP（A120?101P） ?
檢測方式：增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL），建議使用高靈敏度底物（如 SuperSignal West Dura）。
WB 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程
1. 樣本制備： ?
推薦陽性對照：HeLa、HEK293、U2OS 或其它人類細(xì)胞系全裂解液。 ?
裂解緩沖液：RIPA（50?mM Tris?HCl pH?7.4, 150?mM NaCl, 1% NP?40, 0.5% 脫氧膽酸鈉, 0.1% SDS）添加蛋白酶抑制劑（PMSF + ?cocktail）。 ?
上樣量：20–40?μg 總蛋白（MDC1 為中等豐度蛋白，過量上樣可能造成拖尾）。
2. 電泳： ?
使用?3?8% Tris?乙酸酯預(yù)制膠或自配膠。 ?
電泳緩沖液：Tris?乙酸酯 SDS 運(yùn)行緩沖液。 ?
電壓：150?V 恒壓，約 60?80 分鐘。
3. 轉(zhuǎn)?。??
推薦?PVDF 膜（0.45?μm），甲醇活化后轉(zhuǎn)印。 ?
轉(zhuǎn)印條件：30?V 恒壓，4?°C 過夜（或 250?mA 恒流，120 分鐘）。 ?
可使用麗春紅染色確認(rèn)轉(zhuǎn)印效率及分子量位置。
4. 封閉： ?
5% 脫脂牛奶 / TBST，室溫?fù)u動 1 小時。
5. 一抗孵育： ?
用?5% 牛奶 / TBST 將抗體稀釋至 1:10,000 – 1:25,000（首次實(shí)驗(yàn)建議從 1:10,000 開始）。 ?4?°C 輕搖過夜（16?18 小時）。
6. 洗滌： ?
TBST 洗滌 4 次，每次 8 分鐘。
7. 二抗孵育： ?
用?5% 牛奶 / TBST 稀釋 HRP?山羊抗兔二抗（如 1:10,000）。 ?
室溫孵育?1 小時。
8. 再次洗滌（同步驟 6），ECL 檢測。
> 性能預(yù)期：在合適條件下，應(yīng)在約 220–250?kDa 處檢測到單一條帶。若在 200?kDa 以下出現(xiàn)多條帶，可能是蛋白降解或非特異性結(jié)合；建議增加蛋白酶抑制劑并適當(dāng)提高一抗稀釋度。
免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）
用量：6?μg 抗體 / mg 總蛋白裂解液 ?
樣本要求：使用非變性裂解緩沖液（如?50?mM Tris pH?7.4, 150?mM NaCl, 1% NP?40, 不含 SDS，添加蛋白酶和磷酸酶抑制劑）。 ?
推薦對照：使用同型兔?IgG 作為陰性對照（針對非特異性結(jié)合）。
IP 詳細(xì)步驟
1. 裂解： ?
收集細(xì)胞（約?5–10 × 10?），加入 500?μL IP 裂解液，冰上裂解 30 分鐘。 ?
4?°C，12,000?×g 離心 15 分鐘，取上清。
2. 預(yù)清除（可選）： ?
加入?20?μL Protein?A/G 磁珠（或瓊脂糖珠），4?°C 旋轉(zhuǎn) 1 小時，取上清。
3. 抗體結(jié)合： ?
測定裂解液蛋白濃度（BCA 法）。 ?
取?1?mg 總蛋白，加入 6?μg A300-051A 抗體。 ?
4?°C 旋轉(zhuǎn)孵育 2 小時或過夜。
4. 捕獲免疫復(fù)合物： ?
加入?30?μL Protein?A 磁珠，4?°C 繼續(xù)旋轉(zhuǎn) 1?–?2 小時。
5. 洗滌： ?
用?IP 裂解液洗滌磁珠 4 次（每次 500?μL，4?°C，磁力架分離）。
6. 洗脫： ?
加入?30?μL 2× SDS 上樣緩沖液（含 DTT），95?°C 加熱 10 分鐘。 ?
取上清進(jìn)行?SDS?PAGE 及 WB 檢測。
IP 后 WB 的特殊注意事項(xiàng)
由于免疫沉淀洗脫液中存在抗體輕鏈（≈25?kDa）和重鏈（≈55?kDa），而 MDC1 分子量為 220?kDa（遠(yuǎn)高于重鏈），理論上常規(guī)二抗（抗兔 IgG H+L）不會產(chǎn)生干擾。但仍建議使用 抗兔 IgG 輕鏈特異性 HRP 二抗，并在封閉液中添加 5% 正常豬血清（貨號 S100?020），以徹底消除殘余重鏈信號的可能性。
