影響因子：6.1

研究概述：

系統(tǒng)性硬化癥(SSc)是一種以組織纖維化為特征的自身免疫性疾病，可發(fā)生在軀干、四肢和內(nèi)臟器官的皮膚中。由于缺乏可以停止或逆轉(zhuǎn)纖維化過程的治療方法，肺纖維化可導(dǎo)致間質(zhì)性肺病(ILD)的發(fā)生，這也是SSc死亡的主要原因。根據(jù)SSc亞型和用于定義不同國家ILD的標準，SSc患者ILD的患病率在25%至90%之間；而系統(tǒng)性硬化癥相關(guān)的間質(zhì)性肺病(SSc-ILD)主要發(fā)生在30-55歲的女性中。特發(fā)性肺纖維化(IPF)在大約60-75歲的男性中更為普遍。SSc-ILD比IPF發(fā)生得更早、進展更快。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞通過吸引免疫細胞和刺激膠原過度產(chǎn)生在肺纖維化中起著關(guān)鍵作用。目前，以確定了三種類型的巨噬細胞(FCN1，F(xiàn)ABP4和SPP1)參與肺纖維化的發(fā)病機制。攜帶MERTK和LGMN的SPP1巨噬細胞可能促進促纖維化活性。而SPP1巨噬細胞組在SSc-ILD和IPF中表達上調(diào)。本研究旨在通過單細胞分析以確定SSc-ILD和IPF之間的差異，同時闡明其獨特的病因，為該疾病的預(yù)防和治療提出指導(dǎo)方向。

研究結(jié)果：

ILD樣本分析

作者首先對四名IPF患者、三名SSc-ILD患者和來自GSE159354數(shù)據(jù)集的三名HCs樣本(健康對照組)進行了scRNA-seq(圖1A)，并通過使用Seurat軟件對過濾后的基因進行了批量校正。接著，作者對兩組SSc-ILD或伴HCs的IPF患者的樣本進行了生物信息學(xué)分析，共分析了約200500個細胞(圖1B)。最終在含有HCs的SSc-ILD組中鑒定出19個簇(圖1C)，在和含有HCs的IPF組中鑒定出23個簇(圖1D)。而根據(jù)用于注釋和識別簇的標記基因發(fā)現(xiàn)兩組細胞簇相似(圖1C, D)。

肺巨噬細胞執(zhí)行SSc-ILD特異性的MAPK信號通路

作者通過對所有樣本的富集分析發(fā)現(xiàn)有2個聚類組與肺纖維化高度相關(guān)：炎癥過程和補體級聯(lián)以及傷口愈合過程(圖1E)。由于這兩組樣本(SSc-ILD, IPF)表現(xiàn)出相似的聚類模式和GO富集結(jié)果，作者進一步進行了MCODE分析。結(jié)果顯示，在SSc-ILD組中發(fā)現(xiàn)了絲裂原活化激酶磷酸酶(MAPK)信號通路，但在IPF組中沒有。因此，作者想確定哪一組細胞執(zhí)行了MAPK。通過對成纖維細胞、上皮細胞、單核細胞、肺泡巨噬細胞和巨噬細胞的KEGG富集分析分析發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞執(zhí)行執(zhí)行了MAPK(圖S1G-J, 圖1F)；相比之下，IPF中的同一組巨噬細胞經(jīng)歷了Th17細胞分化(圖1F)。

單核細胞來源的肺巨噬細胞

在簇2、簇4和簇7的單核細胞/巨噬細胞中，差異表達基因(DEGs)包括簇2中的FCN1、S100A8和IL1B；簇4中的APOC1、MARCO、FABP4和SPP1；以及簇7中的HLA-DPB1、GPR183和CCL3(圖2A)。而根據(jù)CellMarker 2.0數(shù)據(jù)庫注釋，簇2、4和7分別對應(yīng)于單核細胞、肺泡巨噬細胞和巨噬細胞(圖2B)。為了確定這些簇內(nèi)巨噬細胞的來源，作者進行了單細胞RNA-seq擬時序分析以區(qū)分這三種細胞類型之間的相似性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從單核細胞開始到達肺泡巨噬細胞，首先必須穿過巨噬細胞；而從單核細胞到肺泡巨噬細胞和巨噬細胞有不同的分化途徑。因此，作者推測巨噬細胞與單核細胞的關(guān)系更為密切，而肺泡巨噬細胞可能更早到達肺組織并經(jīng)歷更多分化，最終導(dǎo)致與單核分子的顯著差異。因此，作者得出結(jié)論，巨噬細胞更有可能是從單核細胞分化而來(圖2C)。

SSc-ILD肺泡巨噬細胞亞群

最開始，作者使用已發(fā)表的數(shù)據(jù)集GSE212109，對5名SSc-ILD患者和6名HC患者的肺組織樣本進行了分析(圖1A)。在scRNA-seq分析中，作者共鑒定出27個簇(圖2D)。根據(jù)用于注釋簇和分配標識的標記基因，簇2和簇7對應(yīng)于單核細胞；簇8對應(yīng)于巨噬細胞；簇1、簇3、簇12和簇26對應(yīng)于肺泡巨噬細胞。在肺泡巨噬細胞亞群中，簇1由表達FABP4和MARCO標志物的細胞組成；簇3和簇26為表達SPP1的細胞組成；簇12由同時表達FAPB4和SPP1的細胞組成(圖2E)。該結(jié)果與已發(fā)表的數(shù)據(jù)集GSE159354一致。在這里，作者確定了兩組簇4-肺泡巨噬細胞，一組具有關(guān)鍵基因FABP4和MARCO，另一組具有MARCO和SPP1關(guān)鍵基因(圖2A)。

細胞-細胞相互作用推斷(配體-受體相互作用)

鑒于基因表達的差異，作者接下來將重點轉(zhuǎn)移到了細胞間相互作用是如何導(dǎo)致SSc-ILD以及導(dǎo)致與IPF相比更早的疾病發(fā)作。通過候選信號通路的細胞簇相互作用之間的功能差異，作者觀察到II型肺泡細胞、上皮細胞、分泌細胞和杯狀細胞在損傷后傾向于產(chǎn)生UGPR1、SAA和補體信號通路(圖3A, B)。UGPR1激活攜帶MARCO的肺泡巨噬細胞(圖3C)，而補體信號通路影響肺泡巨噬細胞以驅(qū)動額外的免疫和修復(fù)反應(yīng)(圖3D)。相比之下，SAA作用于單核細胞并引發(fā)隨后的炎癥反應(yīng)(圖3E)。隨后，肺泡巨噬細胞產(chǎn)生SPP1和BAFF(圖3F, G)。值得注意的是，SPP1不僅作用于成纖維細胞和上皮細胞進行即時修復(fù)(圖3F)，還靶向單核細胞進一步通過VEGF和VISFATIN信號通路啟動另一種修復(fù)途徑(圖3H, I)。而在單核細胞內(nèi)，巨噬細胞的一個獨特亞群通過與內(nèi)皮細胞特異性相互作用來執(zhí)行這一信號通路。研究證實，BAFF與B細胞相互作用，產(chǎn)生被認為與自身免疫反應(yīng)相關(guān)的自身抗體。

IL-6通常被認為是一種炎性細胞因子，作者觀察到IL-6并非由典型的免疫或炎性細胞產(chǎn)生的，而是由成纖維細胞、肌成纖維細胞和內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，它作用于上皮細胞以促進修復(fù)過程(圖3J)。作者還發(fā)現(xiàn)許多細胞，特別是肥大細胞，會產(chǎn)生ANNEXN，主要作用于單核細胞和肺泡巨噬細胞，而不影響巨噬細胞(圖3K)。研究表明，ANNEXIN通過甲酰肽受體(FPR)抑制炎癥反應(yīng)。然而，巨噬細胞缺乏膜聯(lián)蛋白FPR軸信號通路。而當(dāng)巨噬細胞不受ANNEXIN抑制時，這可能是VEGF和VISFATIN持續(xù)作用的原因。

作者還發(fā)現(xiàn)肥大細胞在單核細胞的反饋抑制中起著關(guān)鍵作用。在之前的研究中，發(fā)現(xiàn)單核細胞具有FPR1和FPR2兩種膜聯(lián)蛋白受體。FPR1主要表現(xiàn)出抗炎作用，而FPR2有助于單核細胞分化為巨噬細胞，以實現(xiàn)外排細胞的作用。然而，在SSc-ILD中，一旦單核細胞分化為巨噬細胞，F(xiàn)PR1和FPR2便都消失了(圖S2F)，這使得肥大細胞對巨噬細胞的反饋抑制被消除。相比之下，IPF中的單核細胞僅具有FPR1，分化為巨噬細胞后，剩余的FPR1出現(xiàn)。因此，在IPF中，肥大細胞的反饋抑制在單核細胞、肺泡巨噬細胞和巨噬細胞中持續(xù)存在(圖S2G)。

SSc-ILD的生物學(xué)途徑和發(fā)病機制

圖3L展示了SSc-ILD的生物學(xué)途徑。研究表明，當(dāng)肺組織中的前線細胞(如II型肺泡、上皮、分泌和杯狀細胞)暴露于外部或內(nèi)部損傷時，它們最初會向肺泡巨噬細胞發(fā)送UGPR1信號。因此，肺泡巨噬細胞通過SPP1激活成纖維細胞和其他細胞，如肌纖維細胞和內(nèi)皮細胞。內(nèi)皮細胞可通過內(nèi)皮細胞到肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)變(EndMT)和伴隨的微血管稀疏來充當(dāng)肌成纖維細胞的來源。隨后，通過IL6、ERK和pI3k-Akt通路驅(qū)動上皮細胞和成纖維細胞等細胞繼續(xù)修復(fù)受損組織，該修復(fù)過程有助于肺纖維化(圖3L)。

此外，肺泡巨噬細胞產(chǎn)生的SPP1驅(qū)動單核細胞，在招募的單核細胞中，由于SSc的缺氧特性，一些分化為特定的巨噬細胞激活VEGF和VISFATIN信號通路，進一步驅(qū)動下游p38-MAPK通路。這一過程有助于肺纖維化的發(fā)展(圖3L)。雖然存在抑制肺泡巨噬細胞和單核細胞的機制，特別是肥大細胞通過ANNEXIN抑制炎癥，但這種反饋機制并不作用于巨噬細胞。因此，氧化應(yīng)激引起的炎癥無法被抑制，導(dǎo)致惡性循環(huán)和炎癥誘導(dǎo)的肺纖維化的早期加速發(fā)作。肺泡巨噬細胞還通過BAFF驅(qū)動B細胞產(chǎn)生自身抗體，這可能會持續(xù)影響自身免疫。

肺巨噬細胞MAPK信號通路的p38-MAPK和JUN

作者觀察到激活MAPK信號通路的巨噬細胞的這一特定亞群導(dǎo)致SSc-ILD的早期發(fā)作。隨后作者使用SCENIC來預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子(TFs)和推斷的靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了兩組調(diào)節(jié)子：第一組包BCLAF1、IRF1和NFE2L2；第二組包括JUN、FOS和FOSB(圖4A)。而在這兩個調(diào)控子組中，每個TF的靶基因都屬于MAPK信號通路(圖4B)。通過分析TF和靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，BCLAF1調(diào)節(jié)IRF1、NFE2L2和JUN；同時，JUN受FOS和FOSB的調(diào)節(jié)，這會影響其下游基因(圖4C)。

轉(zhuǎn)錄因子的藥物靶向預(yù)測

由于巨噬細胞TFs是MAPK信號通路的重要靶點。因此作者使用了DrugBank數(shù)據(jù)庫以繪制針對這些TFs的藥物圖譜。在潛在的藥物中，作者選擇了對TFs具有下調(diào)作用的藥物，并排除了具有爭議性性結(jié)果或?qū)ζ渌鸗Fs具有上調(diào)作用的藥物。此外，我們將選擇范圍縮小到adjusted p <0.05 (表1)。最后發(fā)現(xiàn)二甲雙胍下調(diào)NFE2L2。眾所值周，二甲雙胍是一種雙胍類藥物，用于治療2型糖尿病。它在其他疾病中也有優(yōu)勢，包括癌癥和肝腎疾病。研究也證實二甲雙胍可以以劑量依賴的方式抑制Raf和ERK的磷酸化，從而進一步抑制NFE2L2的表達。

研究總結(jié)：

本研究基于GEO的單細胞測序數(shù)據(jù)集(GSE159354和GSE212109)，通過對健康對照組、IPF組和SSc-ILD組的肺組織樣本進行單細胞分析發(fā)現(xiàn)，在SSc-ILD的肺損傷初期，成纖維細胞在SPP1肺泡巨噬細胞的影響下激活I(lǐng)L6通路。然而，IL6似乎與其他炎癥和免疫細胞無關(guān)。同時，作者們還觀察到激活MAPK信號通路的巨噬細胞的特定亞群。而與IPF相比，由于SSc-ILD缺乏來自膜聯(lián)蛋白的抑制反饋和自身免疫特性，作者推斷這可能是SSc-ILD發(fā)病較早和持續(xù)纖維化的原因。最后，作者鑒定出了兩種轉(zhuǎn)錄因子(BCLAF1和NFE2L2)以及它們與MAPK相關(guān)的下游靶基因，這可能是早期預(yù)防和治療的潛在治療靶點。同時，作者發(fā)現(xiàn)二甲雙胍下調(diào)了NFE2L2，而NFE2L2可以作為一種再利用的候選藥物?？傊撗芯堪l(fā)現(xiàn)SSc-ILD和IPF之間存在差異，這些差異可以作為早期預(yù)防和治療的潛在研究方向。