? ? ?引物設(shè)計(jì)有3條基本原則:首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ);其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu);再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。 設(shè)計(jì)軟件一般推薦：primer5/snapgene/Oligo引物設(shè)計(jì)的一般規(guī)則：

（1）長(zhǎng)度盡量選?。?8-30bp?

（2）堿基盡可能隨機(jī)分布，G+C＝45-65%?

（3）Tm = 55℃-68℃

（4）引物序列與非擴(kuò)增區(qū)域無(wú)同源性?

（5）5’末端堿基，無(wú)嚴(yán)格限制，3’末端要求嚴(yán)格配對(duì)

（6）在引物內(nèi), 尤其在3'端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。 兩引物之間尤其在3'端不能互補(bǔ), 以防出現(xiàn)引物二聚體

（7）引物5'端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大, 可在引物設(shè)計(jì)時(shí)在5’端加上限制酶位點(diǎn)、核糖 體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等

（8）引物3’端堿基必須嚴(yán)格配對(duì)， 引物3’端出現(xiàn)連續(xù)三個(gè)的以上的連續(xù)堿基，如GGG、CCC，容易使錯(cuò)誤引發(fā)幾率增加