文章來源：“2025-Nature-Generation of human adult hepatocyte organoids with metabolic functions”.

研究背景

肝臟是代謝功能的核心器官，肝細(xì)胞負(fù)責(zé)糖異生、脂肪酸合成、膽汁酸合成等關(guān)鍵功能?，F(xiàn)代生活方式導(dǎo)致代謝相關(guān)脂肪肝疾病（如非酒精性脂肪肝）成為全球健康挑戰(zhàn)。然而，現(xiàn)有肝細(xì)胞模型難以長(zhǎng)期維持成人肝細(xì)胞的代謝功能，且在體外培養(yǎng)中易發(fā)生“管腺化”退化，阻礙了疾病研究和藥物開發(fā)的進(jìn)展。

圖1：人類成年肝細(xì)胞類器官（HHO）的體外培養(yǎng)與代謝功能驗(yàn)證

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1. 模型構(gòu)建：
   • 培養(yǎng)基設(shè)計(jì)：使用含Wnt通路激活劑（如R-spondin1）、STAT3激活劑（IL-6）的擴(kuò)展培養(yǎng)基（EM），抑制肝細(xì)胞分化信號(hào)（如TGF-β），維持HHO的增殖能力。
   • 形態(tài)觀察：類器官呈三維囊狀結(jié)構(gòu)，直徑隨時(shí)間擴(kuò)展至200-500 μm，培養(yǎng)周期超過6個(gè)月仍保持穩(wěn)定。
2. 功能驗(yàn)證：
   • 免疫熒光染色：
     • 肝細(xì)胞核因子HNF4α（標(biāo)志成熟肝細(xì)胞）和藥物代謝酶CYP3A4高表達(dá)，證實(shí)代謝功能保留。
     • 糖原儲(chǔ)存：PAS染色顯示類器官內(nèi)糖原顆粒分布與體內(nèi)肝細(xì)胞一致。
     • 脂滴生成：油紅O染色顯示HHO可主動(dòng)合成脂滴，模擬脂肪肝病理特征。
   • 對(duì)比傳統(tǒng)模型：傳統(tǒng)2D培養(yǎng)肝細(xì)胞在7天內(nèi)丟失CYP3A4表達(dá)，而HHO在長(zhǎng)期培養(yǎng)中維持功能。

圖2：HHO在小鼠肝臟中的再生能力與結(jié)構(gòu)重建

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1. 移植實(shí)驗(yàn)：
   • 操作流程：將熒光標(biāo)記的HHO移植至免疫缺陷小鼠（如NSG小鼠）肝臟損傷模型（如四氯化碳誘導(dǎo)），術(shù)后4-8周觀察整合情況。
   • 再生效率：移植后HHO存活率>80%，顯著高于原代肝細(xì)胞移植（<30%）。
2. 結(jié)構(gòu)重建：
   • 代謝分區(qū)：
     • 門靜脈區(qū)：再生肝細(xì)胞高表達(dá)尿素循環(huán)酶CPS1，模擬氨代謝功能。
     • 中央靜脈區(qū)：再生細(xì)胞表達(dá)缺氧標(biāo)志物HIF1α和藥物解毒酶CYP2E1，再現(xiàn)體內(nèi)代謝梯度。
   • 功能整合：再生區(qū)域血管化（CD31+內(nèi)皮細(xì)胞）和膽管結(jié)構(gòu)（CK19+膽管上皮細(xì)胞）形成，證明HHO與宿主組織功能耦合。

圖3：HHO成熟誘導(dǎo)與藥物毒性模型構(gòu)建

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1. 成熟誘導(dǎo)策略：
   • 培養(yǎng)基優(yōu)化：
     • 去除EGF以抑制過度增殖，加入地塞米松（促進(jìn)糖異生）和甲狀腺激素T3（增強(qiáng)脂肪酸氧化）。
     • 添加FGF19和Notch抑制劑（DAPT），模擬體內(nèi)肝細(xì)胞成熟信號(hào)。
   • 功能提升：成熟后HHO的CYP3A4酶活性達(dá)到原代肝細(xì)胞的90%，尿素分泌量增加3倍。
2. 藥物毒性測(cè)試：
   • 對(duì)乙酰氨基酚（APAP）模型：
     • 暴露于10 mM APAP 24小時(shí)后，HHO出現(xiàn)ATP水平下降（降低60%）及LDH釋放（增加4倍），模擬藥物性肝損傷。
     • 病理特征：細(xì)胞凋亡（Caspase3激活）和線粒體腫脹（電鏡觀察），與臨床毒性反應(yīng)一致。

圖4：HHO在代謝相關(guān)脂肪肝疾病建模中的應(yīng)用

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1. 體外脂肪肝模型構(gòu)建：

   • 誘導(dǎo)策略：
     • 在高糖高脂培養(yǎng)基（含棕櫚酸/油酸，比例1:2，濃度500 μM）中培養(yǎng)HHO 7天，模擬飲食誘導(dǎo)的代謝紊亂。
     • 添加胰島素（100 nM）和地塞米松（1 μM），增強(qiáng)脂質(zhì)合成信號(hào)。
   • 病理表型：
     • 脂質(zhì)堆積：油紅O染色顯示脂滴面積占比從基礎(chǔ)培養(yǎng)基的5%升至35%，與患者肝臟活檢數(shù)據(jù)（平均30%-40%）高度吻合。
     • 氧化應(yīng)激：活性氧（ROS）水平增加2.8倍，線粒體膜電位下降50%（JC-1染色量化）。

2. 分子機(jī)制解析：

   • 關(guān)鍵通路分析：
     • 免疫印跡顯示SREBP1c（脂質(zhì)合成調(diào)控因子）表達(dá)上調(diào)2倍，PPARα（脂肪酸氧化調(diào)控因子）下調(diào)60%。
     • 炎癥標(biāo)志物TNF-α和IL-6分泌量分別增加4倍和3倍（ELISA檢測(cè)）。
   • 功能損傷驗(yàn)證：
     • 胰島素抵抗：HHO對(duì)葡萄糖攝取的響應(yīng)降低40%（2-NBDG熒光探針定量）。
     • 膽汁酸代謝異常：膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NTCP表達(dá)下降70%，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽汁酸蓄積（LC-MS檢測(cè)增加2.5倍）。

3. 藥物干預(yù)測(cè)試：

   • 治療驗(yàn)證：
     • 使用PPARα激動(dòng)劑（非諾貝特，50 μM）處理3天后，脂滴面積減少55%，ROS水平恢復(fù)至基線。
     • FXR激動(dòng)劑（奧貝膽酸，10 μM）可逆轉(zhuǎn)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，NTCP表達(dá)恢復(fù)至正常水平的80%。

圖5：基于CRISPR的代謝性肝病模型構(gòu)建

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1. 基因編輯實(shí)驗(yàn)：
   • 靶點(diǎn)選擇：敲除PNPLA3（rs738409突變基因，與非酒精性脂肪肝相關(guān)），使用sgRNA與Cas9蛋白共轉(zhuǎn)染HHO。
   • 編輯效率：通過T7E1酶切和測(cè)序驗(yàn)證，敲除效率達(dá)70%-85%。
2. 疾病表型分析：
   • 脂質(zhì)堆積：編輯后HHO的甘油三酯含量增加2.5倍，脂滴面積占比從5%升至25%，模擬患者肝臟病理。
   • 機(jī)制解析：RNA測(cè)序顯示PNPLA3缺失導(dǎo)致脂質(zhì)合成基因（如SREBP1c）上調(diào)，氧化基因（PPARα）下調(diào)，揭示疾病分子機(jī)制。
   • 藥篩應(yīng)用：利用該模型測(cè)試FXR激動(dòng)劑（如奧貝膽酸），顯示脂質(zhì)含量降低40%，驗(yàn)證模型的藥物響應(yīng)性。

研究結(jié)論

1. 技術(shù)突破：通過激活Wnt和STAT3信號(hào)通路，解決了肝細(xì)胞體外擴(kuò)展與功能維持的矛盾，建立了首個(gè)穩(wěn)定、可長(zhǎng)期擴(kuò)增的成人肝細(xì)胞類器官培養(yǎng)系統(tǒng)。
2. 功能優(yōu)勢(shì)：HHO在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出與天然肝細(xì)胞相似的代謝、藥物代謝及再生能力，且功能在長(zhǎng)期培養(yǎng)后仍能維持。
3. 應(yīng)用潛力：
   • 為代謝性肝?。ㄈ缰靖危┑臋C(jī)制研究提供高保真模型。
   • 支持藥物毒性測(cè)試、個(gè)性化醫(yī)療及基因治療（如CRISPR編輯）的開發(fā)。
   • 再生醫(yī)學(xué)中可用于肝損傷修復(fù)或移植替代方案。

意義：該研究填補(bǔ)了成人肝細(xì)胞體外功能模型的空白，為肝臟疾病研究、藥物開發(fā)和臨床治療提供了革新性工具。