通常，在癌癥的研究中，我們用癌癥與正常組織或細(xì)胞相比來倒推可能發(fā)生了什么，從而推測其機(jī)制。但這或許根本無法了解到真實(shí)情況的本質(zhì)，也根本無法稱之為對癌癥的發(fā)生進(jìn)行研究。所以，雖然這個研究是去年發(fā)表的，但我覺得還是非常有價值。希望大家將來的研究中就不要輕易的說研究某某基因在某某癌癥的發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制了...
直接源自重編程人肝細(xì)胞的類器官模擬肝癌的發(fā)生
Modelling liver cancer initiation with organoids derived from directly reprogrammed human hepatocytes
摘要
人肝癌，包括肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管癌，通常確診時已為晚期，且預(yù)后較差。更好地理解癌癥的發(fā)生（cancer initiation，癌癥啟動的意思，從無到有，但是對應(yīng)的中文名詞未不到，所以最終覺得用發(fā)生還是最合適的）可以提供潛在的預(yù)防性治療并增加生存率。研究人類肝癌起始的模型在很大程度上缺失。通過使用直接重編程的人肝臟細(xì)胞（hiHeps）并使p53和RB失活，我們建立了具有肝臟結(jié)構(gòu)和功能的類器官。HiHep類器官被遺傳工程化，以模擬人肝癌的初始變化。真正的（bona fide）肝細(xì)胞癌是通過過度表達(dá)c-Myc而產(chǎn)生的。c-Myc誘導(dǎo)的線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度偶聯(lián)促進(jìn)了肝細(xì)胞癌的發(fā)生，這可能是預(yù)防性治療的靶點(diǎn)。此外，通過對人肝內(nèi)膽管癌的突變的富集分析證實(shí)，Notch和JAK–STAT的聯(lián)合抑制作用可以防止RAS誘導(dǎo)的從肝細(xì)胞向肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞譜系的轉(zhuǎn)化。綜上，hiHep類器官代表了一個可以進(jìn)行基因操縱以模擬癌癥發(fā)病并識別潛在預(yù)防療法的系統(tǒng)。
主要結(jié)果
圖1?具有改良肝結(jié)構(gòu)的hiHep類器官的制備。a制備hiHep類器官的示意圖。此前該課題組通過過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FOXA3, HNF1A和HNF4A讓成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成誘導(dǎo)肝細(xì)胞（hiHep），并通過SV40LT使細(xì)胞擴(kuò)增。bHiHep細(xì)胞自我組織形成類器官，并展現(xiàn)出光滑的球狀結(jié)構(gòu)。比例尺，100 μm。c類器官中hiHep細(xì)胞顯示出伴有橢圓形細(xì)胞核的多邊形形態(tài)（箭），并交織形成膽小管樣結(jié)構(gòu)（箭頭）。比例尺，50 μm。d透射電鏡圖像顯示典型的膽小管結(jié)構(gòu)（箭頭）和緊密連接（箭頭）。比例尺，1 μm。e，具有微絨毛的典型上皮細(xì)胞的透射電鏡圖像（箭頭）。比例尺，1 μm。f，hiHep類器官中富集的線粒體（箭頭，成熟肝細(xì)胞的標(biāo)志）的透射電子顯微鏡圖像。比例尺，0.5 μm。b–f?中的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)了3次，結(jié)果相似。
圖2?HiHep類器官具有改善的肝功能。a，hiHep類器官中肝細(xì)胞特異性蛋白HNF4A和E-cadherin的免疫熒光染色顯示出高表達(dá)，而胎兒肝蛋白甲胎蛋白AFP檢測不到（補(bǔ)充圖1c）。圖像結(jié)果的相似的三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。比例尺，100μm。?b，進(jìn)行主成分分析以比較人類成纖維細(xì)胞，2D培養(yǎng)的hiHep細(xì)胞，hiHep類器官和PHH（原代人肝細(xì)胞，n = 2（成纖維細(xì)胞，2D hiHeps和類器官）和3個（PHH）生物學(xué)獨(dú)立的樣品）的表達(dá)譜。虛線表示PC1的得分為“0”。結(jié)果顯示hiHep類器官聚類情況跟培養(yǎng)的PHHs很相近。c，hiHep類器官和2D hiHeps的RNA測序數(shù)據(jù)的GSEA（基因集富集分析）。與二維培養(yǎng)的hiHeps，hiHep類器官具有更豐富的肝功能，包括糖原存儲，藥物代謝，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和類固醇生物合成（每組n = 2個生物學(xué)獨(dú)立的樣本；?FDR q <25％）。NES，標(biāo)準(zhǔn)化富集評分。d，長期培養(yǎng)的二維hiHeps和hiHep類器官中肝基因的RT–qPCR數(shù)據(jù)（n = 4個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。肝基因持續(xù)表達(dá)了兩個月。e，二維hiHeps和hiHep類器官的增殖速率（n = 3個生物學(xué)獨(dú)立的重復(fù)樣本）。hiHep類器官中肝細(xì)胞增殖速度更低。f，hiHep類器官和2D hiHeps的白蛋白分泌水平通過ELISA測定（n = 4個生物學(xué)獨(dú)立的樣品）。g，糖原存儲量通過比色法（n = 3個生物學(xué)獨(dú)立的樣品）進(jìn)行定量。h，通過ELISA測量APOA1分泌水平（n ＝ 3個生物學(xué)獨(dú)立的樣品）。i，在5 μM睪丸激素中孵育4小時后，通過質(zhì)譜法測量睪丸激素的代謝能力（n = 3個生物學(xué)獨(dú)立的樣品）。解凍后培養(yǎng)2 d的冷凍保存的PHH用作陽性對照。?HepG2細(xì)胞也用作對照。?n.d.，未檢測到。數(shù)據(jù)表示為平均值±s.e.m.在d，f–h中。所有P值均使用雙未配對Student t檢驗(yàn)計算得出。補(bǔ)充表5中提供了統(tǒng)計數(shù)據(jù)的源數(shù)據(jù)。
圖3c-Myc類器官原位移植后真正的HCC的形成。a，GFP（左，對照）和c-Myc（右）類器官中c-Myc蛋白的免疫熒光分析。比例尺，50 μm。b，RT-qPCR分析表明c-Myc相關(guān)基因的誘導(dǎo)持續(xù)了60 d（n = 4個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。數(shù)據(jù)表示為平均值±s.e.m.?c，GFP（左）和c-Myc（右）類器官的形態(tài)。HCC由hi-Hep類器官中的c-Myc過表達(dá)（c-Myc類器官）引發(fā)。比例尺，100 μm。d，來自c-Myc類器官（左）和代表性的c-Myc陽性人HCC的HCC的代表性的體內(nèi)組織H＆E染色（右；參見方法）。注意兩種癌癥都表現(xiàn)出緊湊性（GFP類器官HE染色怎么沒放這里？從下面的圖看，好像也是類似結(jié)構(gòu)...）。箭頭表示高有絲分裂活性（說實(shí)話，這個結(jié)果看起來很模糊）。比例尺，50 μm。e，c-Myc-類器官來源的HCC的c-Myc（左），Ki67（中）和GPC3（右）染色。比例尺，50 μm。在a，c–e中的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)了三次，結(jié)果相似。補(bǔ)充表5中提供了統(tǒng)計數(shù)據(jù)源數(shù)據(jù)。
圖4?HiHep類器官在體外模擬c-Myc誘導(dǎo)的HCC發(fā)生。a，培養(yǎng)過程中c-Myc類器官的代表性H＆E染色。第2代的GFP類器官作為對照。箭指示紊亂的結(jié)構(gòu)。箭頭指示的是細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)比例增加的細(xì)胞。P2 day 16顯示了細(xì)胞核異型性的增多。該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立地重復(fù)了三遍，結(jié)果相似。比例尺，50 μm; P1，通道1；P2，通道2。b，c-Myc類器官富含MYC激活通路。c，c-Myc類器官富含c-Myc特征基因（signature gene，請參見方法）。d，c-Myc類器官中已知的肝癌病因的關(guān)鍵通路基因的GSEA，脂肪肝（左）和肝纖維化（右）（請參見方法和補(bǔ)充表4）。b–d，F(xiàn)DR q <25％；每組n = 2個生物學(xué)獨(dú)立的樣本。
圖5 c-Myc類器官中線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）過度偶聯(lián)。a，GFP（左）和c-Myc（右）類器官中線粒體和ER膜的代表性超微結(jié)構(gòu)圖像。c-Myc類器官中ER膜與線粒體緊靠。箭頭指示ER膜的位置。圖像代表三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似。比例尺，0.5 μm。b，定量分析位于線粒體附近的ER百分比（n = 3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)；每組共分析40張圖片）。c，GSEA表明，c-Myc類器官中富集得到了線粒體的組裝和生物形成（左）和分裂（右）途徑（FDR q <25％）。d，100 μM ATP刺激后線粒體中Ca2+濃度的變化痕跡。數(shù)據(jù)為平均值（每組記錄> 50個細(xì)胞；n = 4個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。e，ATP刺激后Ca2+峰值的定量（n = 4個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)；每組定量> 50個細(xì)胞）。f，c-Myc和GFP類器官（n = 3個生物學(xué)獨(dú)立的樣本）耗氧率（線粒體呼吸）。g，c-Myc類器官中葡萄糖代謝過程的GSEA。FDR q <25％。h，用3 μM MitoSOX上樣（n = 3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）測量ROS的產(chǎn)生。i，c-Myc類器官中對氧化應(yīng)激的細(xì)胞響應(yīng)的GSEA分析。FDR q <25％。j，通過RT-qPCR測定（n = 4個生物學(xué)獨(dú)立的樣品）發(fā)現(xiàn)，在用10 μM Mdivi-1（抑制DRP1，以阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的作用和線粒體分裂）處理10 d的c-Myc類器官中，c-Myc相關(guān)基因的表達(dá)水平下調(diào)（參見方法）。每組c，g，i，n = 2個生物學(xué)獨(dú)立的樣本。數(shù)據(jù)表示為平均值±s.e.m. （b，e，h）和平均值±s.d。（縮略詞）。所有P值均使用雙尾非配對Student t檢驗(yàn)計算得出。補(bǔ)充表2中顯示了流式細(xì)胞術(shù)分析的設(shè)門方法。補(bǔ)充表5中提供了統(tǒng)計學(xué)源數(shù)據(jù)。
圖6 在hiHep類器官中誘導(dǎo)ICC（肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌，另一個主要的肝癌為肝細(xì)胞癌HCC）過程中富集于ICC的基因突變。a，第5天，用富含ICC的致癌突變轉(zhuǎn)染后的hiHep類器官形態(tài)。比例尺，100 μm。b，第13天轉(zhuǎn)染了富含ICC致癌突變的hiHep類器官的組織學(xué)變化。比例尺，50 μm。c，轉(zhuǎn)染了富含ICC致癌突變的hiHep類器官的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化的概況（n = 400個生物學(xué)獨(dú)立的樣品）。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。+，表示有相關(guān)特征（用粉紅色陰影表示）；?，無相關(guān)特征。d，在癌基因轉(zhuǎn)染的hiHep類器官中基因表達(dá)水平的聚類。具有RASG12V過表達(dá)的HiHep類器官顯示出與人類ICC相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)模式（從右側(cè)數(shù)第二個）。通過RT-qPCR在轉(zhuǎn)染了ICC富集突變的類器官中測量了ICC相關(guān)基因的表達(dá)，包括膽管細(xì)胞標(biāo)志物，Notch靶基因，粘蛋白相關(guān)基因和細(xì)胞因子以及肝細(xì)胞基因。RNA測序數(shù)據(jù)用于c-Myc類器官和TCGA提取的人ICC和HCC（請參見方法）。在a-c中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行了3次，結(jié)果相似。補(bǔ)充表5中提供了統(tǒng)計數(shù)據(jù)源數(shù)據(jù)。
圖7 RAS在體內(nèi)和體外均可誘導(dǎo)出ICC特征。a，通過hiHep類器官中的免疫熒光RAS染色確定RAS過表達(dá)。比例尺，50 μm。b，RAS-類器官來源的ICC（左）和RAS突變的人ICC樣本（右）的代表性H＆E染色。比例尺，50 μm。c，在體內(nèi)RAS-類器官來源的ICC中對Ki67，CK19，MUC5和分泌的粘蛋白（阿爾辛藍(lán)）的染色。比例尺，50 μm。d，體內(nèi)RAS-類器官來源的ICC的CK7，SOX9和MUC1染色。由Pwpi.1載體表達(dá)的GFP用于驗(yàn)證ICC是否源自RAS類器官。比例尺，50 μm。e，RAS和類器官衍生的ICC中RAS和CK19的共免疫染色。比例尺，50 μm。f，GESA顯示RAS類器官富含RAS特征基因的表達(dá)（請參見方法；FDR q <25％；每組n = 2個生物學(xué)獨(dú)立的樣品）。g-h，具有ICC（g）和膽管細(xì)胞（h）形態(tài)特征的RAS類器官的代表性透射電鏡圖像， 包括細(xì)胞內(nèi)腔微絨毛形成（g，箭頭）和基底膜形成（h，箭）。比例尺，0.5 μm。?a–e中的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)了3次，結(jié)果相似。g、h的實(shí)驗(yàn)做了一次。
圖8 RAS在ICC形成過程中誘導(dǎo)肝細(xì)胞的譜系轉(zhuǎn)化。a，培養(yǎng)過程中RAS類器官的H＆E染色。箭頭指示在RAS類器官中形成的液泡。比例尺，50 μm。b，免疫熒光染色（左）和MUC5（ICC的標(biāo)記物）表達(dá)的RT-qPCR分析（右；n = 4個生物學(xué)獨(dú)立的樣品）。數(shù)據(jù)表示為平均值±s.d. 比例尺，50 μm。c，RAS類器官中富集到了RAS特征基因。d，GFP和RAS類器官的分級聚類。根據(jù)指定天數(shù)的GFP和RAS類器官的肝和膽管細(xì)胞基因的表達(dá)進(jìn)行分層聚類。肝和膽管細(xì)胞基因的選擇基于Tarlow及其同事的研究37（見補(bǔ)充表3）。e，LPC（liver-progenitor cell，肝臟祖細(xì)胞）標(biāo)記物在GFP器官、RAS類器官和iPSC來源的LPC細(xì)胞中的表達(dá)。來源于iPSC的LPC的數(shù)據(jù)是從Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫（GSE61948）下載的。f，膽管細(xì)胞（左）和LPC富集基因的表達(dá)的歸一化富集分?jǐn)?shù)（右；參見方法）。g，Notch（左）和JAK-STAT（右）信號通路富集于RAS類器官。c,f,g，通過將第2、6和16天的RAS類器官與GFP類器官成對比較，對數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA分析。具體的歸一化富集得分顯示在圖表上。c,f，* FDR?q <25％和P <0.01，g，F(xiàn)DR q <25％; UD，未檢測到。h，用Crenigacestat（Creni，10 μM），Nifuroxazide（Nifu，10 μM）以及Crenigacestat和Nifuroxazide組合治療10 d后RAS類器官的相對細(xì)胞數(shù)（n = 3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。數(shù)據(jù)表示為平均值±s.e.m. P值是使用雙尾非配對Student t檢驗(yàn)計算的。i，用Crenigacestat和Nifuroxazide（n = 4個生物學(xué)獨(dú)立的樣品）處理后，對RAS類器官中ICC相關(guān)基因的定量PCR分析。虛線表示mRNA水平＝ 1。數(shù)據(jù)表示為平均值±s.d。a，b中的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)了3次，結(jié)果相似。c–g，每組n = 2個生物學(xué)獨(dú)立的樣本。補(bǔ)充表5中提供了統(tǒng)計數(shù)據(jù)的源數(shù)據(jù)。
展望
在肝癌的起始過程中，肝癌突變可能與基質(zhì)細(xì)胞相互作用。因此，在未來的研究中可能需要引入其他類型的細(xì)胞，例如免疫系統(tǒng)和基質(zhì)成分。另外，通過逐步引入多個突變來表征腫瘤發(fā)生的進(jìn)化，從而模擬肝癌的進(jìn)展，這是很重要的一點(diǎn)。
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