N6?甲基腺苷（m6A）是mRNA和非編碼RNA中的一種修飾核苷酸，它主要通過促進特定轉錄本的降解來影響基因表達。近期研究強調了這種RNA修飾在癌癥中動態(tài)且依賴于特定環(huán)境的作用，并指出其與腫瘤發(fā)生、免疫逃逸和治療耐藥密切相關。本文綜述了m6A的寫入酶、擦除酶和讀取酶在癌癥中的功能。我們重點闡述了m6A失調如何促進腫瘤發(fā)生過程，包括細胞分化和免疫微環(huán)境重塑。以血液系統(tǒng)惡性腫瘤為例，我們強調了m6A依賴性調控的原理，這些原理可能廣泛適用于多種癌癥類型。值得注意的是，靶向m6A寫入酶甲基轉移酶樣蛋白3（METTL3）的抑制劑已成為潛在的癌癥治療藥物。METTL3抑制劑不僅能破壞m6A依賴性通路，還能提高雙鏈RNA水平，從而激活先天免疫反應和抗腫瘤免疫。我們強調，在癌癥和機制研究中需要高分辨率定量m6A圖譜，以便更好地了解癌癥中m6A模式改 變的特定轉錄本，并確定最有可能從METTL3抑制劑中受益的患者亞組。
N6?甲基腺苷（m6A）是mRNA和長鏈非編碼RNA中最豐富的修飾核苷酸。它于20世紀70年代被發(fā)現(xiàn)是mRNA的組成部分。在擬南芥的一項研究表明，哺乳動物m6A甲基轉移酶樣蛋白3 (METTL3) 的植物同源物缺失會導致發(fā)育缺陷。之后，人們對m6A的功能作用產(chǎn)生了濃厚的興趣。這項研究首次揭示了m6A在多細胞生物中的作用，并闡明了其在發(fā)育中的重要性。隨后，首個全轉錄組m6A定位測序方法的開發(fā)揭示了哺乳動物轉錄組中高度選擇性的甲基化模式，表明m6A可能影響特定的mRNAs和細胞過程。
m6A 修飾途徑涉及寫入酶、擦除酶和讀取酶（圖1）。METTL3與METTL14形成復合物，利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體，將RNA中的腺苷甲基化形成m6A。除了主要的m6A寫入酶METTL3外，METTL16也作為少數(shù)轉錄本的m6A寫入酶（框 1）。擦除酶，例如alkB同源物5 (ALKBH5)和脂肪量與肥胖相關蛋白(FTO)，可以以 α-酮戊二酸 (α-KG) 依賴的方式，在特定位點去除m6A甲基。讀取蛋白包括含有YTH結構域的蛋白YTHDC1（一種核蛋白）以及含有YTH 結構域的家族蛋白YTHDF1、YTHDF2 和YTHDF3（三種幾乎相同的旁系同源蛋白，主要存在于胞質中）。m6A讀取蛋白主要通過結合m6A來調控 RNA 穩(wěn)定性，但它們也能影響其他過程，例如翻譯或剪接。核內m6A讀取蛋白YTHDC1被鑒定為剪接調節(jié)因子transform-2蛋白同源物β (TRA2B) 的相互作用蛋白，并已被證實能夠影響前體mRNA的剪接和核輸出。此外，YTHDC1還能形成核凝聚體（nuclear condensates），保護核內RNA免受降解。相比之下，胞質YTHDF讀取蛋白主要促進RNA降解，這凸顯了m6A讀取蛋白在RNA調控中具有區(qū)室特異性作用。除了直接結合m6A的含YTH結構域的蛋白外，還有其他一些蛋白被認為能夠與m6A相互作用，但它們在體內與m6A的結合方式及其功能仍未完全闡明。m6A修飾可以影響RNA的二級結構，通常會使其線性化，從而增加RNA結合蛋白的可及性。這些蛋白的例子包括RNA結合基序蛋白、X染色體（RBMX）、異質核糖核蛋白C1/C2（HNRNPC）、HNRNPA2B1和胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白（IGF2BP）。然而，m6A誘導的RNA線性化的生理意義尚不清楚。
框1 | METTL16與癌癥
除了甲基轉移酶樣蛋白3 (METTL3)–METTL14寫入復合物外，METTL16也被發(fā)現(xiàn)是一種N6-甲基腺苷(m6A)寫入酶。然而，與METTL3相比，METTL16表現(xiàn)出高度選擇性的靶標特異性。METTL3的缺失會導致poly(A) RNA中m6A幾乎完全丟失（約99%），而剩余的m6A被認為是由METTL16生成的。與多蛋白m6A寫入復合物不同，METTL16作為一種單組分酶發(fā)揮作用，其底物特異性由獨特的RNA二級結構中的5′-UACAGAGAA-3′共有序列決定。METTL16最確定的mRNA靶標是甲硫氨酸腺苷轉移酶2A (MAT2A)，該酶編碼合成S-腺苷甲硫氨酸的酶，S-腺苷甲硫氨酸是一種酶輔因子，可作為多種甲基化事件的甲基供體。METTL16還合成U6小核RNA中的m6A，m6A對剪接至關重要。METTL16對正常細胞和惡性細胞的存活都至關重要。急性髓系白血病中METTL16表達升高，這可能促進白血病干細胞的自我更新，凸顯了其致癌作用。METTL16可能具有非催化功能，尤其是在肝癌和肺癌中，據(jù)報道它能促進翻譯起始復合物的組裝并促進翻譯。
m6A最明確的功能是通過m6A識別蛋白YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3促進胞質RNA降解。m6A誘導的mRNA降解始于mRNA的翻譯。由于m6A修飾會阻礙轉運RNA（tRNA）有效進入核糖體，核糖體會在m6A位點停滯。停滯或碰撞的核糖體似乎會募集YTHDF蛋白以促進其與m6A的結合，從而導致mRNA降解。該過程也可受tRNA調控。tRNA含有多種修飾，其中一種修飾5?甲基羧甲基?2?硫尿苷（mcm5s2U）有助于核糖體避免在m6A位點停滯。在肺癌、結直腸癌和血液癌癥中，mcm5s2UtRNA修飾的上調減少了致癌轉錄本的m6A介導的衰變，可能促進癌癥進展。
然而，在某些情況下，例如MYC mRNA，m6A可能導致mRNA不穩(wěn)定、穩(wěn)定或完全沒有影響，這取決于檢測MYC的特定細胞類型。m6A在MYC中的這些不同結果可能是由于其他RNA結合蛋白與MYC 5′和3′非翻譯區(qū) (UTR) 相互作用，從而導致這些依賴于情景的影響。
當m6A存在于同一mRNA的多個位點時，其影響尤為顯著。這些高度甲基化的轉錄本穩(wěn)定性較差，且在細胞中的表達水平通常較低。除了m6A位點的數(shù)量外，還需要考慮其化學計量比，即基因中特定位點含有m6A的轉錄本比例。值得注意的是，位于對應于長內部外顯子（long?internal exons）區(qū)域的mRNA中的m6A位點通常具有較高的化學計量比，并且與高效的mRNA降解相關。相比之下，位于3′ UTR遠端區(qū)域或外顯子?外顯子連接附近的m6A位點具有較低的化學計量比，且與mRNA降解的相關性較弱。
m6A通路失調與多種疾病相關，尤其是癌癥。在癌癥中，m6A模式的改變會擾亂基因表達并促進腫瘤進展。本文將探討目前對m6A修飾如何影響癌癥的認識。我們首先概述了m6A失調在癌癥中的程度、機制和臨床意義，重點強調其在腫瘤促進和腫瘤抑制中的雙重作用。接下來，我們探討了m6A如何調控癌癥相關通路和過程，包括表觀遺傳調控和先天免疫反應（圖1）。最后，借鑒METTL3抑制劑的研發(fā)經(jīng)驗，我們重點闡述了m6A調控過程的治療意義，并提出了推進m6A靶向癌癥療法未來發(fā)展所需的步驟。
癌癥中m6A的失調
m6A RNA甲基化在癌癥中經(jīng)常發(fā)生異常調控，其甲基化模式在不同類型的腫瘤之間，甚至在同一分子亞型內部也存在差異。這些改變可能源于多種機制，包括m6A甲基化機制的遺傳、轉錄、代謝和空間調控，這些機制共同塑造了癌癥轉錄組并影響疾病進展。
RNA中m6A定位的方法
癌癥生物學中對m6A的興趣日益濃厚，這源于一些研究檢測到了腫瘤環(huán)境中m6A的改變模式。這些研究得益于最初的定位技術，即甲基化RNA免疫沉淀測序 (meRIP-seq) 和一種本質上相同的獨立開發(fā)的方法，即m6A-sequencing。這些方法利用抗m6A抗體對含有m6A的RNA片段進行免疫沉淀和測序。測序結果可以比對形成稱為“m6A peaks”的簇，這些簇是mRNA中含有m6A修飾的約100?200個核苷酸的區(qū)域。這些初步的定位方法在約6000個mRNA中發(fā)現(xiàn)了約13,000個m6A位點。早期對癌癥生物學的應用集中于A549人類肺癌細胞，在5,099個基因中鑒定出9,298個m6A峰。這項研究和其他研究表明，m6A在癌癥中的分布可能與正常組織中的分布不同。
自發(fā)現(xiàn)以來，m6A定位工具取得了長足的進步，實現(xiàn)了單核苷酸分辨率和定量精度。m6A單核苷酸分辨率交聯(lián)和免疫沉(miCLIP)方法通過將m6A抗體交聯(lián)到RNA上并定位精確的交聯(lián)位點，首次實現(xiàn)了轉錄組中m6A位點的核苷酸分辨率定位。然而，m6A并非簡單的“開?關”二元修飾，而是在不同轉錄本中呈現(xiàn)動態(tài)的化學計量比。早期的位點特異性mRNA標記方法，包括SCARLET（位點特異性切割和放射性標記，隨后進行連接輔助提取和薄層色譜）和SCARPET（位點特異性切割和放射性標記，隨后進行純化、核酸外切酶消化和薄層色譜），通過對特定位點進行生化檢測，揭示了m6A化學計量比的變化，從而支持了這一概念。為了全面分析轉錄組中每個位點的m6A化學計量比，新型的m6A定位方法開始區(qū)分高化學計量比和低化學計量比的m6A位點。一種定量方法是RNA修飾靶點鄰近脫氨基法（DART?seq），該方法涉及表達與載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣（APOBEC）RNA修飾酶融合的m6A結合YTH結構域。這種融合蛋白被募集到m6A位點，并將相鄰的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，從而實現(xiàn)化學計量評估。該方法已應用于多種細胞類型和稀有?細胞群，包括造血?細胞（HSCs）和小鼠腦區(qū)。在這些研究中，DART?seq鑒定出多種m6A位點的化學計量比，其中大多數(shù)位點的化學計量比較低，但部分m6A位點的化學計量比較高，并且富集于與細胞信號傳導和代謝相關的通路中。
另一種方法GLORI采用化學方法將所有腺苷轉化為肌苷，但保留m6A位點。因此，由于肌苷被讀取為鳥苷，可以通過全轉錄組測序輕松評估化學計量比。GLORI分析進一步表明，致癌轉錄本（例如MYC）通常含有高化學計量比的m6A位點，在許多情況下，其化學計量比在80%到90%之間。盡管其他?種方法已被證明能夠以單核苷酸分辨率提供m6A化學計量比的高精度定量測量，包括 MAZTER?seq、改進的TadA輔助N6?甲基腺苷測序(eTAM?seq) 和m6A選擇性烯丙基化學標記和測序 (m6A?SAC-seq)，但GLORI似乎具有最高的定量準確性。
近年來，牛津納米孔技術的進步為利用直接RNA測序檢測m6A化學計量比提供了一種新方法。納米孔測序能夠揭示單個長讀長RNA分子中的m6A位點（表1）。納米孔測序的優(yōu)勢在于其測序文庫制備和m6A定量相對簡便，且其定量精度與GLORI相當。
盡管定量m6A定位是一種相對較新的方法，但它在繪制癌癥中m6A異常方面具有巨大潛力。目前，缺乏大規(guī)模數(shù)據(jù)集來比較匹配的正常組織和癌組織樣本的位點m6A化學計量比，這構成了理解癌癥中m6A動態(tài)變化的關鍵空白。許多研究已使用meRIP?seq比較正常組織和癌組織，并識別出m6A水平降低或升高的潛在位點，但該方法缺乏位點特異性和定量的化學計量比測量，而這些測量可以通過更新的方法實現(xiàn)。確保這些圖譜的準確性尤為重要，因為meRIP?seq已得出廣泛結論，即癌癥中m6A的改變發(fā)生在編碼增殖、分化、轉移或治療反應調控因子的mRNA中。這些改變的甲基化事件通常與不同的細胞表型相關，包括腫瘤分期、轉移程度和對治療?預的耐藥性。因此，用更高分辨率的方法驗證這些發(fā)現(xiàn)將有助于確定m6A在癌癥中的動態(tài)和機制。
m6A失調在癌癥中的機制
研究發(fā)現(xiàn)，m6A通路中的許多組分在癌癥中均存在失調，并介導m6A的改變。這些改變包括m6A寫入復合物、擦除蛋白和讀取蛋白的表達異常。其他機制還包括m6A調節(jié)因子的基因改變以及代謝和轉錄失調。這些改變具有臨床意義，因為m6A調節(jié)因子的突變或表達失調會影響患者的生存期和治療反應。
m6A寫入復合物表達改變。在多種癌癥中均觀察到m6A寫入復合物一個或多個組分的表達改變。例如，METTL3在血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實體瘤（如結直腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和肝癌）中均經(jīng)常上調。通常，上調程度為1.5倍至3倍。值得注意的是，m6A的豐度與腫瘤分期相關，并且在轉移性腫瘤中比鄰近的非癌組織高出2?3倍。與此一致的是，METTL3的高表達通常與不良預后相關，進一步說明了其促腫瘤的潛力。
初步研究尋找METTL3和/或METTL14表達增加的癌癥，發(fā)現(xiàn)與其他癌癥相比，它們在急性髓系白血病 (AML)中上調最為顯著。隨后的研究集中于了解AML中的m6A。
METTL3表達增加可能不會均勻地影響所有m6A位點，因為許多m6A位點已經(jīng)以高化學計量比甲基化。因此，METTL3表達升高更有可能選擇性地增加原本甲基化程度較低的位點的m6A化學計量比。這提示METTL3在癌癥中的過表達可能通過導致m6A出現(xiàn)在通常不含m6A的位點而賦予功能獲得性表型。重要的是，這種功能獲得性效應無法通過野生型細胞中METTL3的敲低方法來研究，因為這種方法會特異性地靶向通常高度甲基化的位點，而無法捕捉新獲得的m6A位點的調控作用。這凸顯了采用其他實驗策略（例如功能獲得性研究或位點特異性誘變）來全面了解癌癥中m6A修飾模式的必要性。
值得注意的是，單個m6A修飾組分的上調并不一定會增加整體m6A水平，而且許多研究并未直接評估m(xù)6A的化學計量比是否發(fā)生改變。事實上，不同的研究報道了不同癌癥中m6A水平的升高和降低。此外，尚不清楚每種癌癥是否都依賴于這些改變的m6A水平。難點在于m6A廣泛存在于各種轉錄本中，并且影響著眾多細胞通路，這使得確定因果關系變得困難（框2）。
框2 | 解讀m6A圖譜的技術挑戰(zhàn)
確定受N6-甲基腺苷 (m6A) 直接調控的mRNA對于理解m6A如何調控細胞功能至關重要。然而，區(qū)分受m6A直接影響的mRNA和受m6A依賴性通路影響的mRNA極具挑戰(zhàn)性。其中一個原因是含有m6A結合位點的轉錄本數(shù)量眾多，這使得人們很容易得出結論：任何受m6A耗竭影響的轉錄本都是m6A的直接靶標。然而，由于大多數(shù)m6A結合位點的化學計量比較低，這些位點不太可能對mRNA產(chǎn)生顯著的調控作用。在大多數(shù)情況下，研究報告了m6A的癌癥特異性變化，并鑒定出僅在正常細胞或癌細胞中定位的m6A結合位點。然而，這些定位研究是在定量m6A定位方法出現(xiàn)之前進行的。他們依賴于早期基于信號峰的方法，這些方法使用固定閾值來確定m6A位點的存在與否。因此，被鑒定為癌癥選擇性的m6A位點可能僅僅反映了在正常組織中略低于閾值、而在癌癥組織中略高于閾值的信號峰。這種差異可能源于測量中的正常變異，尤其是在信號峰高度被認為是噪聲的情況下，這會給人以癌癥特異性的誤導性印象。如果這些差異具有實際意義，則可能反映了m6A化學計量比的微小變化，即該位點含有m6A的轉錄本的百分比。例如，化學計量比為2%的位點可能變?yōu)?%，這可能是一個非常大的倍數(shù)變化，并在定位研究中表現(xiàn)為癌癥選擇性m6A位點。然而，由于m6A的總體化學計量比較低，此類變化可能生物學意義有限，并且不會顯著影響整體基因表達。一個主要目標是識別發(fā)生顯著化學計量比變化的癌癥特異性m6A位點。盡管如此，m6A的較小變化也可能具有意義。由于m6A通常以簇狀形式存在，低化學計量比位點簇可能提供足夠的m6A總量以賦予生物學功能。隨著新技術的出現(xiàn)，重新評估癌癥轉錄組至關重要，以確定先前報道的癌癥中m6A模式的變化反映的是m6A位點的總體增加或減少、所有m6A位點化學計量比的整體增加或減少，還是位點特異性的化學計量比變化。
m6A消除酶的表達改變。m6A消除酶，例如ALKBH5和FTO，在多種癌癥類型中均表現(xiàn)出表達失調。ALKBH5在急性髓系白血病（AML）、膠質母細胞瘤、乳腺癌和胰腺癌中表達上調，而在肝癌、結腸癌、胃癌和膀胱癌中表達通常降低。值得注意的是，ALKBH5似乎對特定位點具有高度選擇性，而非非特異性的m6A去甲基化酶。因此，ALKBH5表達的變化可能不會顯著影響整體m6A水平，而是會影響特定的轉錄本和通路。
FTO表達的改變也具有情境依賴性，在急性髓系白血病（AML）、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌和肺癌中均有報道其表達增加，而在肝癌、甲狀腺癌、卵巢癌和腎細胞癌中則有報道其表達降低。盡管FTO最廣為人知的功能是其去甲基化m6A，但最近一項研究采用Oxford納米孔直接RNA測序方法定量了對照組和FTO敲低的AML細胞系中m6A的精確化學計量比。在未經(jīng)同行評審的預印本中，該研究小組報告稱，FTO敲低對任何可檢測到的mRNA位點的m6A均無影響。值得注意的是，F(xiàn)TO敲低并未影響MYCmRNA中任何m6A位點的化學計量比，而MYC mRNA通常被認為是FTO的靶點。盡管這些結果需要進一步驗證，但它們挑戰(zhàn)了FTO依賴性調控m6A在癌癥中的作用這一概念。值得注意的是，除了其作為m6A去甲基酶的廣泛研究之外，生物化學研究還表明，FTO對N6, 2′-O-二甲基腺苷（m6Am）的去甲基化效率更高，m6Am是m6A的一種相關修飾。m6Am選擇性地位于mRNA和小核RNA的7-甲基鳥苷帽結構相鄰的第一個核苷酸位置。四環(huán)素甲基胞嘧啶雙加氧酶2(TET2) mRNA上的m6Am修飾已被證實能增強其翻譯效率，而催化m6Am沉積的m6Am甲基轉移酶PCIF1-C端結合蛋白2 (CTBP2)復合物與促進頭頸部鱗狀細胞癌的致癌程序有關。大多數(shù)研究FTO在癌癥中作用的研究并未區(qū)分其作用源于m6A還是m6Am的變化，因為區(qū)分這兩種修飾在技術上仍然具有挑戰(zhàn)性。平行實驗結合FTO耗竭（可增加m6A和m6Am）以及METTL3或PCIF1耗竭（可選擇性地降低m6A或m6Am），可以闡明FTO的作用是通過其中一種還是另一種介導的。
m6A閱讀器的表達發(fā)生改變。最近一項泛癌分析檢測了癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中31種腫瘤類型近10,000個樣本中的16個m6A核心因子，揭示了顯著的跨腫瘤模式。其中，VIRMA、YTHDF1和YTHDF3是癌癥中最常擴增和過表達的基因，而YTHDF2則經(jīng)常下調。與未上調的腫瘤樣本相比，VIRMA、YTHDF1和YTHDF3的上調與更差的預后相關，而YTHDF2下調則預示著更好的預后。這些因素也表現(xiàn)出對無進展生存期具有一致的泛癌預測能力。相比之下，與其他m6A相關因子相比，METTL3在腫瘤中高表達的頻率明顯較低，并且缺乏對患者生存期的預測能力，盡管之前的報道表明METTL3高表達與不良預后相關。
盡管這項泛癌分析提供了關于各種癌癥類型中m6A修飾機制常見基因表達改變的概覽，但它并未涵蓋單個腫瘤類型中存在的全部改變。例如，在急性髓系白血病（AML）中，YTHDF2和YTHDC1過度表達，并在維持白血病?細胞活和保護正常造血?細胞（HSCs）方面發(fā)揮關鍵作用。同樣，YTHDF2高表達與膠質瘤患者預后不良相關，并且在臨床前模型中，YTHDF2促進膠質母細胞瘤細胞增殖、侵襲和腫瘤發(fā)生。
基因改變。m6A調控因子的表達改變與癌癥相關，然而，如上所述，與大多數(shù)癌癥相關基因不同，m6A調節(jié)因子的突變相對罕見。根據(jù)TCGA的數(shù)據(jù)，僅有2%的癌癥表現(xiàn)出METTL3基因的遺傳改變（包括擴增、突變和缺失）。相比之下，常見腫瘤抑制基因TP53的基因改變在癌癥患者中的患病率約為40%。
m6A基因改變的一個顯著例子是RNA結合基序蛋白15 (RBM15，也稱為OTT1)，它是m6A寫入復合物中的關鍵RNA結合蛋白。造血干細胞(HSCs)中RBM15的缺失會顯著降低HSCs的功能，并且其缺失的表型與HSCs中METTL3缺失的許多特征相似。涉及RBM15的一個高度相關的基因改變是染色體易位 t(1;22)，它產(chǎn)生一種與巨核細胞白血病1（MKL1，也稱為MAL、BSAC和MRTFA）的融合蛋白，這種融合蛋白最常見于兒童急性巨核細胞白血病 (AMKL)。更具體地說，RBM15的一個4 kb內含子區(qū)域（位于編碼C端SPOC結構域的外顯子下游）與MKL1內的一個內含子融合。由此產(chǎn)生的剪接轉錄本生成了一個RBM15-MKL1同框融合蛋白，該融合蛋白包含兩個基因的幾乎全長編碼序列，從而產(chǎn)生一個含有1,833個氨基酸的嵌合蛋白。
盡管RBM15?MKL1驅動急性髓系白血?。ˋMKL）的確切機制尚不清楚，但其保留了RBM15和MKL1的功能域，提示其可能通過保留的功能和新功能參與白血病發(fā)生。RBM15調控造血?細胞（HSCs）的命運，并對譜系分化（包括髓系和巨核系分化）發(fā)揮抑制作用，這可能有助于RBM15?MKL1介導的白血病發(fā)生。此外，RBM15和RBM15?MKL1融合蛋白均通過RBM15的SPOC結構域與組蛋白賴氨酸N?甲基轉移酶SETD1B相互作用。這種與SPOC結構域的相互作用對于RBM15?MKL1促進AMKL細胞增殖和存活的致白血病作用至關重要。因此，RBM15?MKL1的致白血病作用可能至少部分是通過改變SETD1B依賴的表觀遺傳程序介導的。此外，RBM15與RNA剪接蛋白剪接因子3B亞基1 (SF3B1)和U2AF94結合。HSCs中RBM15的缺失會導致血小板生成素受體MPL的選擇性剪接，從而產(chǎn)生截短形式的MPL。這種異常亞型會損害血小板生成素信號傳導，并降低HSCs移植到小鼠體內后的植入率。RBM15?MKL1與在5?7%的BCR?ABL陰性骨髓增生性腫瘤中發(fā)現(xiàn)的過度激活的MPL（通過MPLW515L突變）協(xié)同作用，在小鼠中誘導急性髓系白血病(AMKL)的發(fā)生，提示RBM15?MKL1可能通過異常調控剪接來驅動白血病發(fā)生。然而，RBM15?MKL1是否影響m6A修飾尚不清楚，目前也尚無研究將AMKL患者中RBM15?MKL1的高表達與m6A水平的改變聯(lián)系起來。
RBM15?MKL1融合蛋白的部分效應可能歸因于MKL1，MKL1作為血清反應因子（SRF）的轉錄共激活因子，激活與細胞周期和巨核細胞分化相關的基因。與天然MKL1蛋白不同，后者在血清刺激或Rho GTPase激活后可在細胞質和細胞核之間穿梭，而RBM15-MKL1則完全定位于細胞核內。因此，RBM15?MKL1能夠組成性地激活SRF依賴性轉錄。此外，RBM15?MKL1還能增強重組結合蛋白抑制因子（recombining binding protein suppressor of hairless，RBPJ）的轉錄活性。這一過程依賴于RBM15的RNA識別基序（介導其與RBPJ的相互作用）以及MKL1的轉錄激活結構域（轉錄激活所必需的結構域）。RBM15–MKL1通過RBPJ介導的轉錄激活對于經(jīng)基因工程改造表達該融合蛋白的AMKL細胞的生長至關重要。因此，RBM15的m6A調節(jié)功能可能并不參與RBM15–MKL1融合蛋白的致癌作用。
m6A通路中另一個與癌癥相關的突變是METTL14R298P突變。據(jù)cBioPortal報道，METTL14中的R298P突變是一種罕見事件，在分析的10,953例患者中僅有7例發(fā)現(xiàn)。當這種突變出現(xiàn)時，它通常與子宮內膜癌相關，存在于1.5%的子宮內膜癌腫瘤中，并顯著改變METTL3-METTL14甲基化復合物的甲基化活性。R298殘基位于該復合物假定的RNA結合槽附近，因此對靶標識別至關重要。在子宮內膜癌細胞中雜合敲入R298P突變可增強細胞增殖和腫瘤形成。同樣，METTL14-R298P的過表達促進肝癌細胞的生長。這種突變改變了m6A寫入復合物的結合偏好，導致轉錄組中出現(xiàn)新的m6A修飾模式。MYC被確定為METTL14-R298P的關鍵下游靶點，因為MYC mRNA的甲基化促進了致癌轉錄程序。在METTL14的R298位點，在胰腺癌和結腸腺癌等癌癥中發(fā)現(xiàn)了其他罕見突變（R298H和R298C），這些突變同樣改變了底物結合特異性。在膽管癌中，R298H變體則表現(xiàn)為功能喪失突變，這與METTL14在該背景下的抑癌作用相一致。
然而，METTL14?R298突變的致癌潛仍有待充分闡明。關于該突變是否足以啟動腫瘤、其對維持腫瘤的必要性以及其對腫瘤進展的具體影響階段等關鍵問題仍未得到解答。此外，選擇性靶向METTL14?R298P作為治療策略的潛也尚未得到探索。
除了m6A修飾酶的突變外，mRNA中的同義突變（synonymous mutations）也被證明會影響RNA的甲基化能力。例如，在細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A (CDKN2A)和乳腺癌2型易感蛋白 (BRCA2)中已發(fā)現(xiàn)去除m6A位點的此類同義突變，導致mRNA穩(wěn)定性降低和腫瘤發(fā)生增強。
m6A的轉錄失調。導致m6A模式改變的機制可能包括剪接改變，這在癌癥中經(jīng)常觀察到。由于甲基化在長的內部外顯子中發(fā)生得更加有效（圖1），因此改變外顯子大小的剪接事件可能會影響甲基化化學計量。? 轉錄速度是影響m6A甲基化模式的另一個因素。轉錄速度慢會導致mRNA上m6A甲基化效率更高，而RNA聚合酶II的快速轉錄活性則會降低甲基化水平。因此，轉錄速度的改變，例如當RNA聚合酶II延伸缺陷時（這種情況已在乳腺癌和白血病中報道，可能導致m6A模式的失調。mRNA生物合成過程中m6A甲基化的確切時間尚不清楚。? 目前尚不清楚m6A的形成是發(fā)生在轉錄過程中、剪接前或剪接后，還是發(fā)生在完全加工的mRNA上。然而，m6A模式的改變可能源于mRNA生命周期不同階段甲基化動態(tài)的變化。因此，繪制新生、加工和成熟mRNA轉錄本上的m6A圖譜，有助于深入了解甲基化失調的時間。
m6A的代謝失調。癌癥中的代謝改變也會影響m6A的調控。一些報道表明，癌癥中已報道的SAM水平改變可以調節(jié)METTL3的甲基化效率。然而，SAM水平調節(jié)METTL3的觀點與先前報道的METTL3催化甲基化反應中SAM的Km值相矛盾，該Km值約為102nM。SAM的這種高親和結合表明，METTL3的活性對SAM水平的波動基本不敏感，預計SAM水平將保持在微摩爾范圍(>10μM)。
在異檸檬酸脫氫酶1 (IDH1) 或IDH2 發(fā)生突變的癌癥中，突變酶獲得新的活性，將α-酮戊二酸(α-KG) 轉化為癌代謝物R-2-羥基戊二酸 (R-2HG)。R-2HG的結構與α-KG相似，它作為α-KG依賴性雙加氧酶（包括FTO和其他去甲基化酶）的競爭性抑制劑發(fā)揮作用。因此，R-2HG可以通過抑制甲基化酶的功能來增加m6A水平。對于FTO而言，它在急性髓系白血病 (AML) 中可能發(fā)揮癌基因的作用（詳見下文），IDH突變可以繞過對FTO活性的依賴性。R-2HG抑制其他α-KG依賴性腫瘤抑制性雙加氧酶，例如TET2，從而增強MYC表達和腫瘤細胞存活。在膠質瘤模型中也觀察到了類似的效果，這凸顯了代謝調控和遺傳背景在決定FTO致癌作用方面存在的情景依賴性相互作用。
METTL3的細胞定位。盡管在大多數(shù)細胞系中METTL3位于細胞核內，但在某些細胞系以及肺癌、胃癌和前列腺癌的活檢樣本中，METTL3也表現(xiàn)出胞質定位。在胞質中，METTL3可能通過增強致癌mRNA的翻譯發(fā)揮作用。在肺腺癌中，胞質METTL3同時結合靶mRNA的m6A修飾的3′UTR和真核起始因子3H (eIF3H)，后者與mRNA帽結構相關。這種相互作用誘導mRNA環(huán)化，從而促進核糖體重新進入，進而增強翻譯。該機制被認為能夠促進m6A依賴性的表皮生長因子受體 (EGFR)、具有PDZ結合基序的轉錄共激活因子 (TAZ)、含溴結構域蛋白4 (BRD4)和CD9的翻譯增加。METTL3也可能通過與胞質聚腺苷酸結合蛋白1 (PABPC1)結合并穩(wěn)定其與5′端帽結合復合物eIF4F的相互作用，來促進非m6A修飾的mRNA 的翻譯。因此，METTL3在翻譯過程中可能具有催化依賴性和非催化依賴性功能。
METTL3的胞質定位也可能降低核甲基化水平。在乳腺癌中，METTL3的乙酰化增強了其胞質定位，導致核內METTL3減少。這種甲基化模式的改變會影響mRNA的穩(wěn)定性，最終導致轉移和侵襲能下降。
m6A調控癌癥相關信號通路
m6A可通過甲基化參與這些通路的關鍵靶轉錄本，顯著影響多種信號通路，包括PI3K?AKT?mTOR和WNT?β?catenin通路。例如，在急性髓系白血病（AML）中，METTL3介導的甲基化導致細胞信號傳導發(fā)生改變，從而直接或間接地導致包括MYC、BCL2、PTEN和SP1在內的?種關鍵癌癥相關轉錄本水平升高（圖2）。MYC mRNA高度富含m6A修飾，且m6A似乎直接調控MYCmRNA。在急性髓系白血病（AML）細胞中，m6A缺失會增加MYC mRNA水平，而在造血?細胞（HSCs）、宮頸癌細胞和結直腸癌細胞中，則會降低MYC水平。此外，m6A缺失還會降低AML細胞和胸腺癌細胞中MYC的翻譯。m6A在不同細胞環(huán)境下對MYC產(chǎn)生不同影響的能力，以及其促進MYC翻譯的能力，表明MYC的5′UTR已經(jīng)進化出利用m6A的非常規(guī)方式。這可能涉及改變RNA結構或誘導獨特的蛋白質?RNA相互作用。
參與關鍵細胞生長和信號通路（包括PI3K-mTOR、RAS-RAF、MEK-ERK、轉化生長因子-β (TGFβ) 和WNT-β-catenin通路）的轉錄本中m6A修飾的增加，與通路激活和轉移促進密切相關。此外，m6A水平升高與細胞遷移、侵襲和轉移增強有關。例如，在結直腸癌和前列腺癌中，METTL3的缺失會損害體外細胞的遷移和侵襲能力。在乳腺癌腦轉移病例中，先前與轉移相關的基因（包括α-N-乙酰半乳糖胺α2,6-唾液酸轉移酶5(ST6GALNAC5)、間隙連接α-1蛋白(GJA1)和EGFR的mRNA中的m6A修飾會增加它們的穩(wěn)定性。這種穩(wěn)定性進一步促進腦轉移，增強癌細胞與腦內皮細胞和星形膠質細胞的相互作用。
m6A寫入復合物的其他組分，例如METTL14和前體mRNA剪接調節(jié)因子WTAP，也與癌癥信號通路相關。這些蛋白目前已知的唯一功能是促進m6A催化，因此任何與這些蛋白相關的致癌機制都被認為是m6A依賴性的。具體而言，這兩種蛋白均與m6A在癌癥相關轉錄本上的沉積有關，包括EGFR、MYC和CTNNB1（編碼β-catenin），通過增強這些靶標的穩(wěn)定性和翻譯，影響細胞增殖、信號傳導和細胞周期進程。
m6A閱讀蛋白也參與腫瘤發(fā)生相關的信號通路。YTHDC1通過控制核內MYC mRNA的穩(wěn)定性來促進AML細胞的存活和分化（圖2）。盡管YTHDF閱讀蛋白在mRNA去穩(wěn)定化方面的作用已得到證實，但關于它們在癌癥中的作用仍存在相互矛盾的數(shù)據(jù)。例如，YTHDF2似乎在膠質母細胞瘤中會使LXRA和HIVEP2轉錄本不穩(wěn)定，但在其他情況下，它對關鍵致癌mRNA（如MYC）具有穩(wěn)定作用，并且血管內皮生長因子受體(VEGFR)的表達得以維持。這些發(fā)現(xiàn)提示可能存在細胞類型特異性因子，這些因子可以將YTHDF2的一般mRNA去穩(wěn)定化功能轉化為mRNA穩(wěn)定化功能。這種可能性值得進一步研究。
除了作為寫入酶和讀取酶外，m6A擦除酶在癌癥信號通路中也發(fā)揮著依賴于情景的作用。例如，ALKBH5促進急性髓系白血病（AML）、乳腺癌、膠質母細胞瘤和婦科癌癥中癌癥?細胞的自我更新。在AML中，ALKBH5通過轉錄后調控轉化酸性卷曲螺旋蛋白3（TACC3）和受體酪氨酸激酶AXL來促進白血病?細胞（leukaemia stem cell，LSC）的維持。
對于FTO而言，已有報道指出其對致癌和抑癌信號通路具有情景依賴性效應。在急性髓系白血?。ˋML）中，F(xiàn)TO過表達通過阻斷髓系分化、增強有氧糖酵解和維持白血病干細胞更新來促進白血病進展。從機制上講，F(xiàn)TO介導的m6A去甲基化可穩(wěn)定致癌mRNA，例如MYC和血小板磷酸果糖激酶（PFKP），同時以m6A依賴的方式抑制其他mRNA，例如錨蛋白重復序列和SOCS盒蛋白2（ASB2）（圖2）。小分子FTO抑制劑（例如FB23和CS1）在臨床前研究中顯示出強大的抗白血病作用。在黑色素瘤中，F(xiàn)TO上調通過穩(wěn)定PDCD1（編碼PD1）和其他mRNA來阻礙抗PD-1療法。在乳腺癌或胃癌中，F(xiàn)TO通過m6A依賴性調控關鍵mRNA和長鏈非編碼RNA來降低細胞凋亡并促進轉移。FTO在肝細胞癌、卵巢癌和乳頭狀甲狀腺癌中也發(fā)揮抑癌作用。在肝細胞癌中，F(xiàn)TO下調促進腫瘤進展，這種下調是由SIRT1誘導的FTO SUMO化介導的。在卵巢癌干細胞中，F(xiàn)TO通過增強環(huán)磷酸腺苷 (cAMP) 信號傳導和磷酸二酯酶基因PDE1C和PDE4B的mRNA去甲基化來降低干性。在乳頭狀甲狀腺癌中，F(xiàn)TO通過IGF2BP2依賴性方式使載脂蛋白E (APOE) mRNA不穩(wěn)定來抑制糖酵解和細胞生長。
m6A在癌癥信號通路中的潛在抑癌作用。盡管m6A修飾程序通常與腫瘤發(fā)生相關，但多項研究表明，在某些情況下，METTL3和METTL14可以發(fā)揮抑癌基因的作用。METTL14缺陷通過降低整體m6A水平，并抑制PH結構域富含亮氨酸重復序列的蛋白磷酸酶2 (PHLPP2)，以及增強mTORC2復合物三個組分（包括PRR5、PRR5L和mTOR本身）的RNA穩(wěn)定性，從而促進致癌的AKT信號通路，進而增強子宮內膜癌細胞的增殖和致瘤性。因此，在某些情況下，m6A的減少可能通過調節(jié)某些細胞類型中表現(xiàn)出抗癌作用的特定mRNA來抑制腫瘤。
m6A和癌癥中的表觀遺傳失調
m6A修飾發(fā)生在細胞核內，與轉錄同時發(fā)生或轉錄后不久發(fā)生。一些研究表明，由于組蛋白的翻譯后修飾，RNA甲基化機制被募集到染色質上。METTL3似乎也能直接結合某些轉錄因子，包括急性髓系白血病(AML) 中的CCAAT/增強子結合蛋白?ζ (CEBPZ)。通過這種方式，METTL3可以優(yōu)先靶向特定的轉錄本，包括一些編碼控制細胞命運的轉錄因子（例如SP1）。
m6A和核凝聚體（nuclear?condensates）
m6A可通過其核內閱讀器YTHDC1影響表觀遺傳調控。YTHDC1在細胞核內聚集形成顆粒狀結構，這些結構最初被稱為YT bodies。這些凝聚體與核斑點（nuclear speckles, 由SC35核標記物標記）、超級增強子凝聚體（由BRD4標記）和其他核體（nuclear bodies）部分重疊，表明細胞核內存在復雜的空間動態(tài)。
YTHDC1顆粒可能反映了其在多蛋白凝聚體中的富集。已知YTHDC1通過結合m6A mRNA進入凝聚體，因為在m6A缺陷細胞中，YTHDC1不再富集于凝聚體。當YTHDC1與具有多個m6A位點的RNA結合時，它很容易發(fā)生相分離，這可能增強其進入凝聚體的能力。這種機制類似于胞質YTHDF蛋白，它們同樣定位于凝聚體，依賴于與m6A mRNA的結合。YTHDF胞質凝聚體有助于應激顆粒、P小體和其他RNA顆粒的形成，這些顆粒能夠實現(xiàn)區(qū)室特異性的轉錄后調控。
YTHDC1凝聚體似乎能夠調控染色質相互作用并募集轉錄調控因子，從而導致基因抑制或激活。支持這一觀點的是，YTHDC1介導的轉錄激活與增強子相關凝聚體的形成有關，這些凝聚體能夠募集共激活因子BRD4。新生RNA m6A修飾譜分析表明，包括增強子RNA在內的轉錄調控元件會被選擇性地進行m6A修飾。這些m6A標記的增強子RNA與高活性增強子相關，它們能夠募集YTHDC1，促進核內凝聚體的形成，其中一些凝聚體與BRD4相互作用，從而驅動基因激活。
除了與超級增強子凝聚體相互作用以驅動基因激活外，YTHDC1在維持核斑點完整性方面也發(fā)揮著重要作用。核斑點通常與活躍的轉錄位點相鄰，并參與正常和轉錄應激條件下的基因表達調控。核斑點形成的關鍵成分是核長非編碼RNAMALAT1，已知其經(jīng)過大量m6A修飾。MALAT1中m6A位點的缺失會破壞YTHDC1定位到核斑點，而YTHDC1的缺失會導致斑點內蛋白質組成發(fā)生改變，這凸顯了YTHDC1在核斑點組裝中的作用。
核斑點的另一個關鍵組成部分是SON蛋白，其mRNA也是細胞中m6A修飾程度最高的mRNA之一。SON與造血?細胞（HSCs）命運調控密切相關，m6A的缺失會破壞SON蛋白的豐度和核斑點的形成，從而降低HSCs的自我更新能力和分化潛能。這些研究強調了m6A?YTHDC1凝聚體與其他核凝聚體之間的相互作用，從而協(xié)同調控基因表達。
除了在基因激活中的作用外，YTHDC1凝聚體還能保護m6A修飾的轉錄本免受核降解，從而增強致癌信號傳導。例如，在AML細胞中，YTHDC1?m6A凝聚體隔離MYC mRNA并保護其免受外泌體相關的RNA降解。
YTHDC1核凝集物的蛋白質組組成仍未完全明確。然而，已有研究表明RBMX與YTHDC1相互作用。此外，RBMX還能結合某些m6A修飾的轉錄本，這種結合是由m6A誘導的RNA二級結構線性化所促進的，線性化過程暴露出一個可被RBMX9識別的RNA結合基序。這種相互作用對于新生RNA轉錄本尤為重要，RBMX通過RNA聚合酶II在轉錄過程中與其結合，從而參與共轉錄剪接的調控。在急性髓系白血病（AML）中，RBMX控制異染色質蛋白CBX5的新生轉錄，并且是髓系白血病發(fā)生所必需的。區(qū)分RBMX對新生轉錄的調控是否依賴于YTHDC1或m6A，或者是否獨立發(fā)揮作用，這一點至關重要。在某些情況下，RBMX可能獨立于這些因子發(fā)揮作用，參與調控特定轉錄本，例如AML中的CBX5。需要進一步研究來闡明這些相互作用及其相關的分子機制。
m6A和表觀遺傳調控因子
許多研究YTHDC1相互作用組的研究發(fā)現(xiàn)了表觀遺傳調控因子，支持了m6A可通過YTHDC1影響表觀遺傳狀態(tài)的觀點。據(jù)推測，X非活性特異性轉錄本（XIST）介導的基因沉默因其m6A修飾而增強，這導致YTHDC1和染色質修飾因子（如多梳抑制復合物1 (PRC1)）在293T細胞和小鼠胚胎干細胞中的募集。然而，YTHDC1與XIST結合導致基因沉默的機制仍不清楚。最近的研究表明，組蛋白修飾因子在YTHDC1與m6A修飾的轉錄本結合后與其相互作用，盡管關于其對基因表達影響的報道有時并不一致。例如，內源性逆轉錄病毒元件（endogenous retroviral elements, EREs）上的m6A修飾可通過YTHDC1誘導轉錄抑制，YTHDC1可募集H3K9甲基轉移酶SETDB1和三方基序28（TRIM28），從而在小鼠胚胎干細胞中建立H3K9me3。相反，YTHDC1也被證實可募集H3K9去甲基化酶KDM3B至關鍵發(fā)育基因，例如Jam2、Hoxc12、Cbln1和Tbx3，從而促進這些基因在小鼠胚胎干細胞中的表達。目前尚不清楚是什么決定了YTHDC1與H3K9甲基轉移酶或去甲基化酶相互作用的特異性，從而調控基因表達。
此外，YTHDC1在染色質相關調控RNA（chromatin-associated regulatory RNAs, carRNAs）的核轉錄降解中也發(fā)揮著相反的作用。YTHDC1與m6A修飾的carRNAs結合，并通過YTHDC1與核外泌體靶向復合物的結合促進其降解。這種降解會使附近的基因表達失活，這與YTHDC1通過增強子相關凝聚體增加轉錄的作用形成對比。
總體而言，m6A在RNA穩(wěn)定性和基因表達中發(fā)揮的相反作用在各種類型的新生RNA中均有體現(xiàn)，包括carRNAs、pre?mRNAs和EREs。這引發(fā)了關于這些不同效應的調控機制及其在不同細胞環(huán)境中的調控方式的關鍵問題。深入了解癌細胞中的這些機制對于理解m6A如何根據(jù)細胞和癌癥類型促進或抑制腫瘤至關重要。
m6A控制細胞狀態(tài)和分化
m6A調控的關鍵在于其對情景的依賴性效應，尤其是在發(fā)育的特定階段，m6A會影響細胞命運的決定。小鼠胚胎?細胞的研究就是一個很好的例子。在原始多能性狀態(tài)下，METTL3的缺失會導致分化失敗，這是由于多能性相關轉錄本（如Oct4和Nanog）的穩(wěn)定性增加所致。然而，在已啟動的胚胎?細胞中，METTL3的缺失會導致分化增強。這些發(fā)現(xiàn)強調了METTL3缺失時細胞所處的特定狀態(tài)對于決定最終表型的重要性。類似地，在正常造血?細胞（HSCs）中，METTL3的缺失會導致功能異常的?細胞擴增，這些?細胞無法正常分化，其表型與原始多能?細胞相似。相反，在急性髓系白血?。ˋML）細胞中，METTL3的缺失會促進髓系分化并降低增殖。
盡管METTL3在源自癌癥?細胞的癌癥中發(fā)揮重要作用，例如在急性髓系白血病（AML）和膠質母細胞瘤模型中，但METTL3在分化型腫瘤中也同樣必需，例如源自上皮細胞的腫瘤，包括結直腸癌、前列腺癌和肺癌。這表明m6A的調控機制可能因腫瘤細胞的起源而異。然而，并非所有研究都能明確定義分化狀態(tài)和起源細胞，其與特定類型癌癥?細胞狀態(tài)的確切關聯(lián)仍不清楚。但是，這些觀察結果表明，METTL3的作用取決于細胞環(huán)境、需要不同的轉錄程序才能存活或分化的特定細胞狀態(tài)。
還應注意的是，m6A的精確含量也可能很重要。例如，有報道稱，利用基因敲低方法，METTL3在膠質母細胞瘤中既可以作為抑癌基因，也可以作為癌基因發(fā)揮作用，這表明m6A的水平可能導致腫瘤中不同的功能結果。
m6A調控細胞狀態(tài)的另一個例子體現(xiàn)在轉移過程中。研究表明，m6A可通過上皮間質轉化（EMT）促進轉移。EMT相關基因，包括E?鈣黏蛋白(CDH1)和波形蛋白(VIM)，受關鍵轉錄因子核因子I/B (NFIB) 的調控。NFIB mRNA上的m6A修飾可穩(wěn)定其表達，從而維持EMT相關因子的轉錄程序，進而促進前列腺癌轉移。然而，這種mRNA穩(wěn)定作用并不像m6A通常對轉錄本的去穩(wěn)定作用那樣常見。
其他m6A調節(jié)因子也表現(xiàn)出細胞情景依賴性作用。例如，YTHDF2的耗竭可選擇性地消除LSCs，同時促進正常HSCs的擴增及其植入能力。類似地，ALKBH5的耗竭會導致LSCs的丟失，同時保留和維持正常的HSCs。
因此，m6A在各種細胞環(huán)境中可以發(fā)揮雙重作用，根據(jù)m6A閱讀器、寫入器或擦除器的表達、細胞類型和分化狀態(tài)，發(fā)揮促腫瘤和抑腫瘤作用。
m6A調節(jié)增殖和DNA損傷
m6A在關鍵的細胞過程中發(fā)揮著至關重要的作用，包括細胞周期進程和DNA損傷反應。這些過程對于正常細胞功能和癌癥進展都至關重要，凸顯了在疾病背景下靶向m6A調控的治療潛和挑戰(zhàn)。
m6A和細胞周期進程
已知m6A可驅動細胞不受控制的增殖。m6A在調控細胞周期進程中的作用最初是在神經(jīng)祖細胞模型中提出的。在皮層神經(jīng)祖細胞中，METTL14的缺失會導致S期到M期轉換的延長和細胞周期退出的延遲，從而導致神經(jīng)祖細胞數(shù)量減少。通過對小鼠胚胎發(fā)育第13.5天（E13.5）的前腦進行m6A測序（該發(fā)育階段富含神經(jīng)?細胞），研究人員鑒定出了富含m6A的轉錄本，其中包括編碼細胞周期、?細胞和神經(jīng)元分化調控因子的轉錄本。這一發(fā)現(xiàn)強調了m6A在確保發(fā)育中的神經(jīng)組織內細胞分裂及時進行方面的關鍵作用，并提示其失調可能導致細胞增殖增加。
在包括結直腸癌和食管胃交界處腺癌在內的多種癌細胞模型中，一些細胞周期相關基因，例如CDC25B、CDC25A和CCND1，是m6A甲基化的直接靶點。m6A的缺失通常會導致這些細胞的細胞周期延遲，從而在體外產(chǎn)生抗增殖和抗癌效應。這種表型凸顯了靶向m6A調控因子在癌癥治療中的應用潛力。然而，值得注意的是，METTL3、METTL14和其他m6A甲基化復合物的組成成分是必需基因。因此，許多研究中觀察到的細胞表型可能間接來源于細胞死亡，而非直接反映其在細胞周期中的調控作用。靶向這些組分進行治療可能會產(chǎn)生毒性。因此，在開發(fā)基于m6A的療法時，必須仔細考慮其潛在的毒性作用。
然而，m6A缺失對細胞周期進程的影響取決于具體情況。例如，在造血干細胞（HSCs）中，m6A耗竭反而會促進細胞增殖。這種差異表明，與m6A對分化的影響類似，干細胞中可能存在其他依賴于具體情況的調控機制，影響著細胞周期進程，而癌細胞則不然。需要進一步研究來闡明這些機制及其對靶向m6A療法的潛在意義。
m6A和DNA損傷反應
m6A在促進DNA損傷修復方面也發(fā)揮著關鍵作用，而DNA損傷修復對于遭受基因毒性壓的細胞的存活至關重要。當暴露于紫外線照射等DNA損傷因子時，m6A標記會動態(tài)地添加到DNA損傷位點合成的RNA上。這些新引入的m6A位點對于募集DNA聚合酶κ（Polκ）至關重要，Polκ是跨損傷合成途徑中的關鍵酶，該途徑使細胞能夠繞過DNA損傷并完成復制。通過將Polκ募集到損傷位點，m6A能夠實現(xiàn)高效的DNA修復，從而促進細胞在基因毒性應激下的存活。
人們可以預測，這種m6A介導的募集過程對于DNA修復機制更依賴于跨損傷合成修復途徑的癌細胞來說尤為重要；例如，對于BRCA突變的癌細胞來說，m6A介導的募集過程可能尤為重要。這種依賴性使得m6A成為潛在的治療靶點，可用于抑制DNA修復。與此觀點一致的是，研究發(fā)現(xiàn)METTL3抑制劑與PARP抑制劑奧拉帕尼具有協(xié)同作用，可在異種移植研究中抑制前列腺癌的進展。此外，據(jù)報道，在肺腺癌中，METTL3缺陷會通過下調mutS同源物5 (MSH5)（參與DNA錯配修復）來損害同源重組修復的效率。因此，METTL3抑制可使肺癌細胞對PARP抑制劑更加敏感。
m6A調節(jié)先天免疫信號傳導和細胞死亡
來自不同領域的新證據(jù)表明，METTL3抑制會導致類似病毒的雙鏈RNA（dsRNA）的誘導，從而觸發(fā)抗病毒免疫反應。這包括激活I型?擾素（IFN）信號通路，并隨后誘導IFN刺激基因（IFN-stimulated genes, ISGs）的表達，這些基因可以刺激抗腫瘤免疫，并激活進化上保守的、用于保護細胞免受病毒感染的內在細胞死亡機制。因此，METTL3抑制劑的作用可能源于其對腫瘤細胞的直接作用以及對靶向腫瘤的免疫細胞的影響（圖3）。值得注意的是，m6A抑制還可以增加編碼IFNβ的轉錄本以及ISGs的轉錄調節(jié)因子的表達，這些因子也有助于ISG的誘導。
m6A抑制也可能穩(wěn)定ISGs轉錄本，因為已發(fā)現(xiàn)許多ISGs被YTHDF2修飾和降解。因此，抑制m6A通路可能導致炎癥表型。這一假設得到了在病毒感染條件下利用遺傳學方法進行的研究的進一步支持。然而，在AT3乳腺癌細胞中的研究發(fā)現(xiàn)，使用METTL3抑制劑治療并不能提高ISGs mRNA的穩(wěn)定性，這暗示在m6A丟失后，可能存在其他通路驅動ISGs激活。值得注意的是，在METTL3抑制之前，ISGs mRNA通常不表達，這表明m6A通路抑制可能在ISGs轉錄誘導后增強其水平方面發(fā)揮更重要的作用，而不是啟動其表達。
在癌細胞以外的多種細胞類型中，m6A抑制均可導致ISGs上調，這表明METTL3抑制劑可能至少部分通過激活非癌細胞的固有免疫反應而間接發(fā)揮抗癌作用。然而，在m6A水平升高的癌細胞中，m6A升高可能具有抑制dsRNA和固有免疫反應的功能。因此，METTL3抑制劑也可能通過抑制這種重要的m6A依賴性生存機制發(fā)揮作用。
METTL3抑制劑激活先天免疫反應，促進免疫細胞浸潤，從而增強腫瘤免疫監(jiān)視，進而促進AT3乳腺癌細胞過繼性T細胞轉移模型中的抗腫瘤免疫。利用m6A抑制實現(xiàn)ISGs激活，為提高抗腫瘤免疫和免疫療法的療效提供了一種有前景的方法，因為促免疫刺激的環(huán)境能夠增強腫瘤對這些治療方式的敏感性。以下詳述的多項證據(jù)支持了這些概念。
在小鼠HSCs中，Mettl3敲除導致dsRNA的積累，激活dsRNA傳感器視黃酸誘導基因I（RIG?I）和黑色素瘤分化相關蛋白5（MDA5），從而觸發(fā)IFN反應并激活蛋白激酶R（PKR）。PKR磷酸化eIF2α，從而損害整體翻譯，而RIG?I通路促進ISGs的轉錄和翻譯。這種表型也見于γδT細胞，其中METTL3缺失導致dsRNA增加和信號轉導及轉錄激活因子1（STAT1）信號通路增強，最終導致具有細胞毒性的γδ T1細胞與γδ T17細胞（與支持腫瘤生長的炎癥微環(huán)境相關）之間的失衡。值得注意的是，在多種癌細胞系（例如人卵巢癌細胞、小鼠AT3三陰性乳腺癌細胞和B16黑色素瘤細胞）中，METTL3的藥理學抑制也會導致dsRNA上調和ISGs激活。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了m6A在調節(jié)dsRNA和ISGs表達中的作用，這是一種在不同細胞環(huán)境中保守的機制。
關于m6A缺失如何導致dsRNA增加的一種假說是，m6A的功能是破壞RNA結構，因此其缺失會導致dsRNA增加。然而，值得注意的是，YTHDF2的缺失也會導致ISGs的誘導，并且YTHDF2缺陷細胞中的mRNA具有升高的m6A水平。因此，更可能的是，通過抑制METTL3或YTHDF來抑制m6A通路足以誘導ISGs。m6A耗竭誘導dsRNA的另一種機制是EREs的去抑制，這些元件易于形成dsRNA。在大多數(shù)情況下，源自EREs的dsRNAs的積累會誘導ISGs的表達。在胚胎?細胞中，m6A通過募集染色質調節(jié)因子（例如SETDB1和TRIM28）來沉默逆轉錄轉座元件，例如內源性逆轉錄病毒、長散在核元件和短散在核元件。因此，m6A的缺失可能導致這些元件的重新激活，進而觸發(fā)dsRNA的形成和ISG的激活。
m6A缺失后，失調的剪接也會導致雙鏈RNA（dsRNA）增加。如上所述，m6A通過影響核斑點組分MALAT1來調控剪接。m6A的缺失會導致核斑點顯著改變，從而損害共轉錄剪接。在免疫冷腫瘤(immune-cold tumors)（例如MYC擴增的癌癥）中，已使用剪接體功能的藥理學抑制劑證實了剪接受損對dsRNA的影響。這種抑制作用會導致內含子滯留水平升高，而這些滯留的內含子更可能包含反向重復元件（例如短散在核元件或Alu元件），這些元件可以激活RIG-I通路。此外，核斑點蛋白SON的過表達可逆轉METTL3缺陷型造血干細胞（HSCs）中dsRNA的積累，部分原因是逆轉了內含子滯留，從而使ISG信號正?；⑼炀菻SC功能。然而，這些反向重復元件與EREs（似乎更豐富）相比的相對貢獻尚不完全清楚。
dsRNA增加的一個主要后果是ISG激活，隨后引發(fā)多種細胞效應，包括細胞死亡。細胞死亡由Z?DNA結合蛋白1（ZBP1）介導，ZBP1與dsRNA結合誘導壞死性凋亡（necroptosis）。然而，在不同的背景或條件下，dsRNA也可能誘導其他形式的細胞死亡，例如凋亡或細胞焦亡。dsRNA是否能夠誘導細胞死亡，仍有待進一步研究。壞死性凋亡是METTL3抑制后細胞死亡的主要形式，或者當其他通路參與該過程時也是如此。值得注意的是，m6A缺失會導致ZBP1表達上調，這提示METTL3抑制可能通過誘導dsRNA及其效應分子ZBP1來誘導細胞死亡。
ISG激活的另一個重要后果是影響腫瘤免疫微環(huán)境。m6A耗竭導致ISG表達，包括趨化因子（如CXCL10或CCL5）的表達，以及與IFNγ反應和I型IFN反應相對應的整體表達模式，這些反應與強烈的免疫激活相關。因此，這些ISGs可能影響抗腫瘤反應，并提高免疫檢查點抑制劑的療效。事實上，最近的研究表明，用METTL3抑制劑治療荷瘤小鼠可誘導免疫反應，促進CD8 T細胞募集和抗原依賴性殺傷。檢查點抑制劑在METTL3抑制背景下增強抗癌作用可能源于雙重機制：一是ISG介導的免疫細胞刺激，二是腫瘤細胞中ZBP1介導的及其他死亡通路激活增強。在免疫功能正常和免疫缺陷的條件下比較METTL3抑制的實驗，有助于深入了解各通路各自的作用。
值得注意的是，METTL3抑制劑還會顯著損害T細胞和樹突狀細胞的發(fā)育和反應。此外，m6A的缺失也會通過影響腫瘤微環(huán)境增強腫瘤的轉移潛能。例如，髓系細胞特異性的m6A缺失會損害SPRED2的翻譯，從而通過ERK通路增強NF-κB和STAT3的激活，最終導致腫瘤生長和轉移增強。這些發(fā)現(xiàn)強調了確保METTL3抑制不會損害關鍵的免疫介導的抗腫瘤機制的重要性。值得注意的是，由于細胞對m6A缺失的反應似乎具有細胞類型特異性，因此，確定這些細胞類型特異性反應的潛在機制對于開發(fā)安全有效的靶向m6A通路的治療策略至關重要。
注意，dsRNA水平可通過dsRNA特異性腺苷脫氨酶（ADAR）降低，該酶可將腺苷脫氨為肌苷，從而降低dsRNA的穩(wěn)定性并抑制下游ISG的響應。因此，ADAR表達或誘導水平的差異可能導致細胞對m6A通路抑制的不同反應。一個可驗證的假設是，將METTL3抑制與ADAR抑制相結合是否能通過增強dsRNA和ISG的響應來促進細胞死亡，從而為靶向以腺苷為基礎修飾的癌細胞提供一種新方法。
以m6A為靶點的癌癥治療
由于抑制m6A可以阻斷促腫瘤的m6A依賴性通路并觸發(fā)先天免疫反應，因此它是一種很有前景的癌癥治療靶點。我們概述了m6A靶向治療領域未來有前景的研究方向（表2），包括旨在增強抗腫瘤效果并最大限度降低脫靶?險的精準治療方法。
首個同類METTL3抑制劑STM2457由STORM Therapeutics公司開發(fā)，該公司通過對超過250,000個化合物進行高通量篩選，隨后對效力、吸收、分布、代謝和排泄（adsorption, distribution, metabolism and excretion, ADME）特性以及體內藥代動力學進行了嚴格的優(yōu)化。STM2457對METTL3-METTL14的半數(shù)抑制濃度為16.9 nM，X射線晶體衍射分析表明STM2457與METTL3-METTL14異二聚體的SAM結合位點結合。這種特異性是通過以下幾個結構因素實現(xiàn)的：STM2457獨特的結構，與SAM或其他已知的甲基轉移酶抑制劑不同；它能夠避開SAM所利用的同型半胱氨酸結合口袋；以及其他機制，例如結合后的構象重排。
在臨床前研究中，STM2457顯示出強大的抗白血病作用，可促進細胞凋亡和分化，同時延緩體內白血病的發(fā)生。這種療效與整體m6A甲基化水平的降低以及致癌驅動基因（如MYC、SP1和BRD4）翻譯水平的下降相關。值得注意的是，STM2457可誘導腫瘤內源性免疫反應，為在免疫腫瘤學領域潛在的協(xié)同應用鋪平了道路。在臨床前模型中，STM2457與抗PD?1療法聯(lián)合使用可增強抗腫瘤活性，凸顯了一種有前景的治療策略。
繼STM2457取得成功后，STORM Therapeutics公司將STM2457的更強效衍生物STC?15推進至I期臨床試驗。早期結果表明，STC?15在多種劑量下均具有良好的耐受性，生物標志物數(shù)據(jù)提示其能夠靶向結合并激活與臨床反應相關的先天免疫通路。這些結果凸顯了METTL3抑制劑作為一種治療策略的潛力，其作用機制不僅在于直接殺傷癌細胞，還在于重塑腫瘤微環(huán)境以增強免疫監(jiān)視功能。
除了METTL3的小分子抑制劑外，還開發(fā)了靶向METTL3的小分子降解劑（表2）。值得注意的例子包括蛋白水解靶向嵌合體（PROTACs），例如ZW27941和WD6305，它們能夠募集E3連接酶Von Hippel-Lindau，從而誘導METTL3和/或METTL14的靶向降解。對于ZW27941和WD6305，METTL3和METTL14均能被有效降解，導致AML模型中m6A甲基化水平降低和細胞活力下降，凸顯了它們作為抗癌藥物的潛力。PROTACs還將靶向METTL3的非催化功能，包括其在胞質溶膠中的非經(jīng)典作用，例如調節(jié)肺癌、前列腺癌和胃癌中的翻譯，如先前所述。然而，這兩項研究都強調需要進一步優(yōu)化，并在動物模型中進行驗證，以提高選擇性和體內療效。這些步驟對于確定PROTACs在癌癥治療中是否優(yōu)于STC-15，或者是否會導致任何額外的毒性至關重要。
m6A擦除器的抑制劑也是癌癥治療領域一個很有前景的研究方向。例如，FTO抑制劑（表2）可以同時影響m6A和m6Am的調控。FTO的這種雙重作用增加了復雜性，尤其是在目前關于FTO抑制導致m6Am水平升高影響的研究有限的情況下。因此，需要進一步研究來厘清m6A和m6Am對觀察到的表型的貢獻，并闡明FTO抑制劑在癌癥治療中的應用潛力。
ALKBH5抑制劑的研發(fā)尚不成熟，但由于ALKBH5參與促進急性髓系白血?。ˋML）和膠質母細胞瘤的腫瘤進展、免疫逃逸和治療耐藥，因此ALKBH5抑制劑正成為新興的研究熱點。ALKBH5小分子抑制劑（表2）已在臨床前研究中展現(xiàn)出抑制其去甲基化酶活性和抑制腫瘤細胞增殖的潛力。
近年來，小分子療法的進展主要集中在靶向m6A閱讀蛋白以精確調控腫瘤特異性過程。有機硒化合物依布硒侖（ebselen）作為一種新型的YTHDF蛋白m6A結合域抑制劑，能夠破壞YTHDF m6A結合域與m6A修飾的mRNA靶標之間的相互作用。然而，依布硒侖缺乏特異性，因為它無法區(qū)分三個YTHDF旁系同源蛋白的結合域，這給其靶向治療應用帶來了挑戰(zhàn)。
類似地，利用體外高通量篩選和基于結構的藥物化學方法，已經(jīng)開發(fā)出靶向YTHDC1的抑制劑（表2）。這些化合物主要與保守的YTH結構域結合，但仍需進一步研究以確定其選擇性，評估與其他含有YTH結構域的蛋白質的交叉反應性，并確定最佳治療劑量。
開發(fā)m6A閱讀器抑制劑的關鍵挑戰(zhàn)在于如何實現(xiàn)所需的特異性，以區(qū)分YTHDC1抑制劑和靶向YTHDF蛋白的抑制劑的作用。此外，區(qū)分密切相關的YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3蛋白同樣至關重要，因為它們具有高度相似的結合域，但在m6A介導的RNA調控中可能發(fā)揮不同的功能作用。分子動學研究表明，這種困難源于它們m6A結合域的高度相似性。盡管靶向這些蛋白質的其他表面區(qū)域可能提供一種潛在的解決方案，但由于缺乏明確的結合口袋或結構限制，這些區(qū)域通常被認為難以成藥。因此，需要開展進一步的研究，以確定克服這些挑戰(zhàn)并實現(xiàn)對特定m6A閱讀器的選擇性靶向的可行策略。
結論與未來方向
m6A RNA修飾是癌癥生物學中的核心調控因子，影響RNA穩(wěn)定性、翻譯、剪接和免疫反應。盡管相關證據(jù)仍在不斷涌現(xiàn)，但m6A可能影響癌癥代謝重編程，這代表了一個有前景的未來研究方向。m6A定位技術的進步加深了我們對m6A在癌癥中的化學計量和功能意義的理解。然而，需要將更新的定量m6A定位方法重新應用于癌癥樣本，以充分驗證先前提出的失調m6A位點。最近一篇預印本報告指出，在使用定量m6A定位時，F(xiàn)TO對任何可檢測到的m6A位點均無影響，這與現(xiàn)有文獻相矛盾，因此有必要重新分析m6A圖譜。此外，針對m6A寫入酶、擦除酶和讀取酶的新興治療方法為抑制癌癥特異性通路提供了有前景的途徑。然而，在實現(xiàn)特異性、最大限度減少脫靶效應以及理解m6A修飾的情景依賴性作用方面，仍然存在挑戰(zhàn)。持續(xù)的研究對于完善這些策略并發(fā)揮m6A的治療潛力至關重要，這將為更有效、更具針對性的癌癥治療鋪平道路。
未來研究的關鍵問題在于確定哪些癌癥類型和治療方案最有可能最大程度地提高METTL3抑制劑和其他靶向m6A通路藥物的療效。鑒于m6A在免疫調節(jié)和DNA損傷修復中的作用，將METTL3抑制劑與免疫檢查點抑制劑或DNA損傷藥物（例如PARP抑制劑）聯(lián)合使用可能產(chǎn)生協(xié)同效應。聯(lián)合使用靶向其他表觀遺傳調控因子的抑制劑是否有效？我們如何預測哪些患者會從中獲益？敏感性和耐藥性的驅動因素是什么？靶向mRNA甲基化程序的其他組成部分（例如FTO、ALKBH5、YTHDC1和YTHDFs）是否會更有效？這些問題可能將通過STC?15的臨床經(jīng)驗直接得到解答，隨后對治療后的遺傳和表觀遺傳反應進行詳細分析。此外，對腫瘤進行全面的分子譜分析對于識別預測這些抑制劑療效的關鍵生物標志物至關重要。功能基因組學和表觀轉錄組學分析也有助于闡明敏感性和耐藥性的潛在機制，從而指導篩選最有可能從聯(lián)合療法中獲益的患者。還需要開展進一步的臨床前和臨床研究，以評估靶向不同癌癥背景中mRNA甲基化程序特定成分的療效。
然而，由于m6A在正常細胞分化和生理功能中的重要性，必須密切監(jiān)測潛在的副作用，包括造血毒性和血細胞減少癥。值得注意的是，在最初使用STM2457治療不同基因型AML患者來源的異種移植模型的研究中，每日給予小鼠50 mg/kg體重的STM2457劑量并未影響骨髓來源的造血?細胞和早期祖細胞的數(shù)量、外周血細胞計數(shù)或小鼠體重。
一項重要的技術考量是不同研究中使用的基因敲低或耗竭程度，這可能是導致不同研究中觀察到的表型復雜多樣的原因之一。目前已證實，m6A調節(jié)因子對整體m6A水平的影響并非線性關系，部分或不充分的耗竭會導致不同的結果，從而使實驗結果的解讀變得復雜。例如，Schwarz等人的研究表明，將METTL3和/或METTL14的敲低程度（至野生型對照組的10%）并未導致m6A水平出現(xiàn)明顯的下降，直到進一步敲低至野生型對照組的5%時，m6A水平才出現(xiàn)顯著下降。因此，必須進行劑量依賴性評估，并仔細檢查m6A丟失和調節(jié)因子耗竭的程度，才能得出準確的結論。
這些見解為癌癥治療的新前沿奠定了基礎，選擇性m6A修飾抑制可能為治療以異常m6A甲基化模式為特征的惡性腫瘤提供新的途徑。
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