首先華大沒有給我塞錢，最近有用華大的測序，就學習了一下。
華大的測序技術起源于 CG(Complete Genomics) 的 cPAL(combinatorial Probe-Anchor Ligation) 測序。
CG 的 cPAL 測序的建庫稱為 DNB(DNA Nanoballs), 利用 RCA(Rolling circle replication) 讓 DNA 擴增成線性的螺旋結構。這個建庫方式優(yōu)點是所有的擴增模板都是最初的插入片段，這樣 PCR 產生的錯誤不會累積，只影響該擴增序列。像 ILLUMINA 的測序如果擴增發(fā)生錯誤，那么后續(xù)擴增會有該錯誤片段作為模板，從而導致錯誤累積。
文庫構建后加入到測序芯片，測序芯片有 DNB 結合位點，一個位點結合一個 DNB.
然后是 cPAL 測序。每輪測序先加入與接頭匹配結合的錨序列（anchor sequence），然后加入大量只有一個熒光標記堿基的探針，該熒光標記堿基在探針的位置由需要測序的位置決定，比如要測第一個堿基，那么就只標記探針第一個堿基，要測第五個堿基就熒光標記探針第五個堿基。探針結合后洗去未結合的探針，然后檢測應該信號，得到序列信息。然后移除所有的結合探針和錨序列，開始下一輪測序。對比 ILLUMINA 的 SBS 測序，優(yōu)點是下一個堿基不依賴于上一堿基，這樣測序錯誤更加隨機。
后來的 BGISEQ-500 儀器使用改進自 cPAL 的 cPAS(combinatorial probe-anchor synthesis) 技術，具體這個 cPAS 技術細節(jié)我沒找到合適材料，但我猜測應該是類似于 ILLUMINA 的 SBS. 有資料的朋友歡迎分享。
MGISEQ-2000 依舊使用 DNB 建庫，但是測序應用了 CoolMPS 新技術。這是一種基于抗體的技術，熒光標記在抗體上，而不是 dNTP 堿基上（因此稱為 cold dNTPs）。這解決了 ILLUMINA 平臺在 dNTP 添加熒光基團會導致 DNA “疤痕” 影響后續(xù)測序準確度。
CoolMPS 技術如下示意。對比 ILLUMINA SBS 主要改進就是將熒光基團標記在抗體上，讓抗體跟堿基特異性結合，從而測序更準確。另外，抗體可攜帶多個熒光基團，讓熒光信號更強。
那么 DNB 建庫后用 CoolMPS 的雙端測序是怎么一個過程呢？如下所示，A 進行 Read1 的引物結合并測序；B 在 Read1 完成后繼續(xù)合成序列，直到下一段序列的 5' 端。C 新合成序列 3' 端到達下一序列 5' 端后，5' 端被置換形成分叉；D 在分叉上進行 Read2 測序。
下圖顯示 CoolMPS 測序前 2 堿基對被測堿基信號影響小。
參考資料
Chen, Fei, et al. "The history and advances of reversible terminators used in new generations of sequencing technology." Genomics, Proteomics & Bioinformatics 11.1 (2013): 34-40.
Drmanac, Snezana, et al. "CoolMPS?: Advanced massively parallel sequencing using antibodies specific to each natural nucleobase." bioRxiv (2020).
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