sanger測序法：

1. 脫靶位點預(yù)測
   1.1 登陸 http://www.rgenome.net/cas-offinder/ 網(wǎng)站，輸入靶點序列，自動預(yù)測易脫靶位點。
   1.2 本次參數(shù):SpCas9 from Streptococcus pyogenes: 5'-NGG-3';Sus scrofa (susScr11) - Pig;Mismatch Number 4;DNA Bulge Size 2;RNA Bulge Size 2。
2. 數(shù)據(jù)篩選與整理
   2.1 下載數(shù)據(jù)后使用excel工具打開并進行篩選，篩選條件根據(jù)自己要求自己設(shè)定，本次設(shè)定：Mismatch Number 1;Bulge Size 2
   2.2 根據(jù)position位置整理信息，三列：chr position+300 position-300
3. 序列抓取
   3.1 登錄 https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/susScr11/bigZips/ 網(wǎng)站，下載豬的基因組序列。
   3.2 解壓數(shù)據(jù)，使用tbtools工具（Fasta Extract（Recommended））進行序列提取，input放入基因組序列，out設(shè)置輸出位置和名字，idlist輸入2.2整理信息，start
4. 引物設(shè)計
   將3.2獲得的序列信息整理到word中，使用bioXM工具輔助設(shè)計引物。
5. PCR擴增、檢測、測序
   使用上步設(shè)計的引物進行擴增，電泳檢測后送公司進行測序。
6. 測序結(jié)果分析
   將預(yù)測脫靶位點上下游300bp序列BLAST到靶點序列，輸出模式為pairwise方便定位靶點信息，定位好靶點信息后，將靶點信息序列在測序峰圖中檢索，確認測序結(jié)果與預(yù)測脫靶位點是否一致，若一致則未脫靶。

高通量測序法：

image.png

1. 脫靶位點預(yù)測
   1.1 登陸 http://www.rgenome.net/cas-offinder/ 網(wǎng)站，輸入靶點序列，自動預(yù)測易脫靶位點。
   1.2 本次參數(shù):SpCas9 from Streptococcus pyogenes: 5'-NGG-3';Sus scrofa (susScr11) - Pig;Mismatch Number 5;DNA Bulge Size 2;RNA Bulge Size 2。
2. 數(shù)據(jù)篩選與整理
   下載數(shù)據(jù)后使用excel工具打開并進行篩選，篩選條件根據(jù)自己要求自己設(shè)定，本次設(shè)定兩個參數(shù)，參數(shù)一：Mismatch Number 2;Bulge Size 1，參數(shù)二：Mismatch Number 0;Bulge Size 2，參數(shù)二：Mismatch Number 3;Bulge Size 0，去除冗余位點后共計99個。
3. 全基因組snp分析
   高通量測序由公司進行，將2中設(shè)定的潛在脫靶位點與產(chǎn)生的SNP位點比對, 若snp位點處于潛在脫靶位點位置序號±20bp 的范圍，進一步進行序列比對，查看是否脫靶。若snp位點處于潛在脫靶位點位置序號±20bp 的范圍之外，則可初步判定該位點未發(fā)生脫靶。

NOTE:

1. DNA Bulge Size
   定義：在sgRNA與DNA靶序列配對時，若DNA鏈上出現(xiàn)無法與sgRNA配對的額外堿基，這些未配對的堿基會在DNA鏈上形成局部凸起（類似“鼓包”），稱為DNA Bulge。
   示例：
   sgRNA序列：A-A-A-A-A
   DNA靶序列：A-A-C-G-A-A-A
   此時，中間的C-G無法與sgRNA配對，導(dǎo)致DNA鏈上出現(xiàn)2個未配對的堿基（Bulge Size=2）。
   意義：
   CRISPR系統(tǒng)（如Cas9）允許DNA靶序列存在少量未配對堿基（Bulge），但仍可能切割。預(yù)測工具通過設(shè)置DNA Bulge Size參數(shù)，可評估允許的DNA凸起大?。ㄈ?、1、2個堿基），從而篩選潛在的脫靶位點。

2. RNA Bulge Size
   定義：若sgRNA鏈上存在無法與DNA靶序列配對的堿基，這些堿基會在RNA鏈上形成凸起，稱為RNA Bulge。
   示例：
   sgRNA序列：A-A-G-A-A-A
   DNA靶序列：A-A-A-A-A
   此處sgRNA中的G無法配對，導(dǎo)致RNA鏈出現(xiàn)1個未配對堿基（Bulge Size=1）。
   意義：
   與DNA Bulge類似，RNA Bulge的存在可能影響CRISPR系統(tǒng)的結(jié)合效率。預(yù)測工具通過設(shè)置RNA Bulge Size參數(shù)，控制允許的RNA凸起大小。

3.為什么需要關(guān)注這兩個參數(shù)？
脫靶效應(yīng)容忍度：CRISPR系統(tǒng)對DNA或RNA鏈上的少量Bulge有一定容忍度，可能導(dǎo)致意外切割（脫靶）。
預(yù)測準確性：
若設(shè)置DNA/RNA Bulge Size=0，僅預(yù)測完全匹配的位點（嚴格，但可能漏檢）；
若設(shè)置Bulge Size=1-2，會納入含凸起的潛在脫靶位點（敏感，但假陽性可能增加）。
實驗設(shè)計：合理調(diào)整這兩個參數(shù)，可平衡預(yù)測結(jié)果的敏感性與特異性，優(yōu)化sgRNA設(shè)計。

4.應(yīng)用示例
假設(shè)使用工具Cas-OFFinder預(yù)測脫靶位點：
若設(shè)置DNA Bulge Size=2，工具會篩選DNA鏈上最多有2個未配對堿基的位點；
若設(shè)置RNA Bulge Size=1，則會納入RNA鏈上有1個未配對堿基的位點。
通過調(diào)整這些參數(shù)，研究者可以更全面地評估sgRNA的潛在脫靶風險，從而設(shè)計出更安全的基因編輯方案