????????PCR或者分子克隆技術(shù)（即基于E.coli等進行的重組質(zhì)粒構(gòu)建）可以實現(xiàn)dsDNA的大量擴增，而基于切口酶的序列特異性識別與單鏈DNA切割活性可以實現(xiàn)目標(biāo)ssDNA的分離。如圖1，在dsDNA（PCR產(chǎn)物或者質(zhì)粒）的同一條ssDNA上使用切口酶產(chǎn)生兩個切口，將DNA變性后進行電泳即可分離到ssDNA。目前切口酶包括類似于限制性內(nèi)切酶的固定序列識別的Nb.BbvCI（圖2） ，特識別特定的序列：CCTCAGC，并在互補鏈上產(chǎn)生一個切口。這類切口酶的一個缺點是固定的識別序列限制了其廣泛使用，如果在目標(biāo)ssDNA中存在識別位點，就只能選擇其他的切口酶。而基于Cas9 Nickase與sgRNA的特異序列識別于切割或許是一個更好的選擇。（PS.與基因編輯中使用Cas9 Nickase不同，在進行ssDNA合成是，需要保證Cas9 Nickase產(chǎn)生的切口在同一條DNA鏈上。）

圖1

圖2 Nb.BbvCI切口酶識別切割位點