急性白血病簡介
急性白血病可分為急性髓細(xì)胞白血病（Acute myeloid leukemia，AML）和急性淋巴細(xì)胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia，ALL）兩種，是成人最常見的血液腫瘤之一。其發(fā)病是由于造血干細(xì)胞發(fā)生惡性增殖并且失去正常分化成熟的能力，使得造血細(xì)胞正常功能受到抑制，導(dǎo)致貧血、出血以及免疫力低下等嚴(yán)重后果。近幾年來，由于CRISPR技術(shù)的發(fā)展，尤其是CRISPR文庫篩選的應(yīng)用，使得大量的急性白血病相關(guān)治療靶點被發(fā)現(xiàn)，多種新型的靶向藥物如IDH1/2抑制劑、FLT3抑制劑、BCL-2抑制劑以及CPX-351等逐步進(jìn)入臨床，引發(fā)了急性白血病治療從化療轉(zhuǎn)向靶向治療的重大變革[1-2]。那么CRISPR文庫篩選到底是如何應(yīng)用在急性白血病的研究中的呢，小源為大家整理了幾篇高分文獻(xiàn)，快一起來學(xué)習(xí)一下吧！
CRISPR文庫篩選應(yīng)用于AML研究
[if !supportLists]1.?[endif]尋找AML細(xì)胞生長必須基因
對于CRISPR文庫篩選，最直接的用法就是篩選細(xì)胞生長必須基因，但是為了確保篩選結(jié)果的可靠性，最好是使用多種不同細(xì)胞系并結(jié)合In vivo模型同步篩選。Lin等人通過數(shù)據(jù)庫篩選后，選擇了200個在AML細(xì)胞系中具有生長依賴的基因，并構(gòu)建了對應(yīng)的AML細(xì)胞生長依賴基因敲除文庫。借助此文庫篩選兩種不同的AML細(xì)胞系MV4-11和U937以及一種腫瘤異種移植模型PDX（patient-derived xenograft）后，研究者們發(fā)現(xiàn)SLC5A3以及MARCH5基因在三種文庫篩選模型中均被顯著下調(diào)（圖1）。進(jìn)一步通過分別構(gòu)建這兩個基因敲除的AML細(xì)胞系進(jìn)行下游機(jī)制研究，他們發(fā)現(xiàn)SLC5A3通過轉(zhuǎn)運(yùn)肌醇支持AML細(xì)胞的增殖，而MARCH5基因則會阻止AML細(xì)胞發(fā)生凋亡[3]。
1. SUSD6基因促進(jìn)AML細(xì)胞產(chǎn)生免疫逃逸
除了篩選細(xì)胞生長必須基因外，使用CRISPR文庫篩選耐藥基因也是常見手段。免疫檢查點療法是一種通過阻斷T細(xì)胞激活的抑制信號，來促進(jìn)抗腫瘤的免疫反應(yīng)，從而實現(xiàn)腫瘤治療的方法，然而某些腫瘤對ICT具有原發(fā)耐藥或產(chǎn)生適應(yīng)性抵抗，導(dǎo)致IDT對這些類型的腫瘤治療無效。為了探究腫瘤細(xì)胞對IDT的耐藥性機(jī)制，研究團(tuán)隊以人AML細(xì)胞系THP-1以及鼠AML細(xì)胞系RN2作為研究對象，使用全基因組敲除文庫結(jié)合流式分選的方法，通過篩選帶熒光標(biāo)記的腫瘤抗原高表達(dá)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SUSD6基因在兩個AML細(xì)胞系中均被顯著富集（圖2），說明SUSD6基因敲除后會促進(jìn)腫瘤抗原的表達(dá)，從而增強(qiáng)免疫檢查點療法的療效。研究團(tuán)隊隨后也通過在細(xì)胞中敲除SUSD6基因并進(jìn)行In vivo實驗后，發(fā)現(xiàn)SUSD6基因通過抑制AML細(xì)胞的MHC-I表達(dá)以及其免疫原性，促進(jìn)細(xì)胞對T細(xì)胞產(chǎn)生免疫逃逸反應(yīng)[4]。
CRISPR文庫篩選應(yīng)用于ALL研究
急性淋巴細(xì)胞白血病可細(xì)分為急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）以及急性B淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）兩種，二者占急性白血病的比例約30%。雖然ALL的發(fā)病率較AML低，但是相比于AML，ALL的治療難度更大，預(yù)后差，目前尚無FDA批準(zhǔn)的ALL治療方法。
1. T-ALL中纈氨酸-tRNA合酶顯著上調(diào)
tRNA生物合成的紊亂常見于腫瘤細(xì)胞中，然而在T-ALL中是否也存在tRNA生物合成紊亂的現(xiàn)象仍然未知。為了探究上述問題，Thandapani等人使用tRNA生物合成相關(guān)基因的敲除文庫對兩個不同T-ALL細(xì)胞系CUTLL1和Jurkat進(jìn)行篩選后發(fā)現(xiàn)，負(fù)責(zé)纈氨酸t(yī)RNA合成的基因VARS在這兩個細(xì)胞中均被顯著下調(diào)（圖3）；同時對T-ALL樣本進(jìn)行分析的結(jié)果表明VARS的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)。以上結(jié)果均說明在T-ALL中，纈氨酸t(yī)RNA生物合成發(fā)生紊亂。為了進(jìn)一步驗證纈氨酸t(yī)RNA生物合成的作用，研究者們在細(xì)胞系中基因敲除VARS基因或在動物水平通過飲食限制纈氨酸的攝入，均能顯著抑制T-ALL增殖并改善T-ALL癥狀[5]（圖4）。
[if !supportLists]1.?[endif]NUDT21基因負(fù)調(diào)控B-ALL中CD19表達(dá)
[if !supportLists]B-[endif]ALL細(xì)胞中跨膜蛋白CD19的表達(dá)缺失使得B-ALL對CAR-T療法產(chǎn)生耐藥性，然而CD19的表達(dá)是如何被調(diào)控的仍然未知。為了探究這一問題，Witkowski等人使用全基因組敲除文庫對3個不同的B-ALL細(xì)胞系Reh、697和NALM6進(jìn)行篩選，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分選出CD19高表達(dá)和低表達(dá)的兩個細(xì)胞類群并進(jìn)行NGS測序分析后，研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)NUDT21基因在這三個細(xì)胞高表達(dá)CD19的細(xì)胞群中均被顯著富集，說明NUDT21基因負(fù)調(diào)控CD19的表達(dá)（圖5）。在確認(rèn)B-ALL中NUDT21高表達(dá)后，研究團(tuán)隊使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了該基因敲除的B-ALL細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)NUDT21基因會直接抑制CD19 mRNA的穩(wěn)定性及其蛋白表達(dá)[6]。
總結(jié)
CRISPR文庫篩選技術(shù)發(fā)展至今已有10年時間，借助CRISPR文庫篩選已在多個不同領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)了大量全新的靶點，也由此產(chǎn)生了諸多高分文章。通過以上案例不難看出，近幾年來，借助CRISPR文庫發(fā)表的高分文章一般有如下幾個共通點：1. 針對某一類疾病使用多種不同細(xì)胞系同步篩選，通過比較分析找出靶點；2. 在找出靶點后，構(gòu)建基因敲除細(xì)胞系進(jìn)行驗證，并展開下游機(jī)制研究。除此之外，使用更小的sgRNA文庫、結(jié)合流式分選以及動物實驗更容易讓你的研究獲得reviewer的青睞。
為了幫助各位研究者們完成更好的研究、發(fā)表高質(zhì)量文章，小源也特地為大家整理了一下急性白血病中常用的各種細(xì)胞系（表1），如果您有研究急性白血病的需求，趕緊收藏起來吧！
參考文獻(xiàn)
[1] Lin T, Liu D, Guan Z, Zhao X, Li S, Wang X, Hou R, Zheng J, Cao J, Shi M. CRISPR screens in mechanism and target discovery for AML. Heliyon. 2024 Apr 9;10(8):e29382.
[2]Kayser S, Levis MJ. Updates on targeted therapies for acute myeloid leukaemia. Br J Haematol. 2022 Jan;196(2):316-328.
[3] Lin S, Larrue C, Scheidegger NK, Seong BKA, Dharia NV, Kuljanin M, Wechsler CS, Kugener G, Robichaud AL, Conway AS, Mashaka T, Mouche S, Adane B, Ryan JA, Mancias JD, Younger ST, Piccioni F, Lee LH, Wunderlich M, Letai A, Tamburini J, Stegmaier K. An?In Vivo?CRISPR Screening Platform for Prioritizing Therapeutic Targets in AML. Cancer Discov. 2022 Feb;12(2):432-449.?
[4] Chen X, Lu Q, Zhou H, Liu J, Nadorp B, Lasry A, Sun Z, Lai B, Rona G, Zhang J, Cammer M, Wang K, Al-Santli W, Ciantra Z, Guo Q, You J, Sengupta D, Boukhris A, Zhang H, Liu C, Cresswell P, Dahia PLM, Pagano M, Aifantis I, Wang J. A membrane-associated MHC-I inhibitory axis for cancer immune evasion. Cell. 2023 Aug 31;186(18):3903-3920.e21.
[5]Thandapani P, Kloetgen A, Witkowski MT, Glytsou C, Lee AK, Wang E, Wang J, LeBoeuf SE, Avrampou K, Papagiannakopoulos T, Tsirigos A, Aifantis I. Valine tRNA levels and availability regulate complex I assembly in leukaemia. Nature. 2022 Jan;601(7893):428-433.?
[6]Witkowski MT, Lee S, Wang E, Lee AK, Talbot A, Ma C, Tsopoulidis N, Brumbaugh J, Zhao Y, Roberts KG, Hogg SJ, Nomikou S, Ghebrechristos YE, Thandapani P, Mullighan CG, Hochedlinger K, Chen W, Abdel-Wahab O, Eyquem J, Aifantis I. NUDT21 limits CD19 levels through alternative mRNA polyadenylation in B cell acute lymphoblastic leukemia. Nat Immunol. 2022 Oct;23(10):1424-1432.?
