最近大家不知道怎么樣了，看到了疫情結束的曙光了，北京租個房子真的貴，勸退能力太強了，o(∩_∩)o 。這一篇分享單細胞空間聯(lián)合分析的知識，關于損傷后的毛囊再生，文章在Spatial anchor of adaptive immune cell around biomaterials mediated large-scale wound regeneration ,看看單細胞空間聯(lián)合分析帶來的分析內(nèi)容
Abstract
一般來說，成年哺乳動物的嚴重傷口只能再生很少的HF（毛囊），這僅限于大傷口中心，稱為傷口誘導的毛囊新生（WIHN）。 整合空間轉錄組 (ST) 和單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 的基因表達譜突出了適應性免疫細胞在大傷口中心與 HF 前體細胞共定位的優(yōu)先聚集。 此外，觀察到無論傷口大小如何，傷口都通過植入細胞外基質(zhì) (ECM) 支架重現(xiàn)了正常的皮膚結構。 適應性免疫細胞在biomaterials周圍的分布擴大，與 HF 前體細胞重疊，可能是biomaterials植入傷口中 WIHN 增強的原因。 在 Rag2-/- 小鼠中喪失 WIHN 的能力驗證了操縱適應性免疫系統(tǒng)對無疤痕傷口再生的潛在治療效果。
Introduction
沒有皮膚附屬物的大面積纖維化瘢痕嚴重影響患者的日常生活，是傷口愈合的主要障礙之一。 ECM 支架是嚴重傷口的有效治療方法之一，但仍缺乏刺激 HF 新生的能力。有趣的是，在 WIHN 模型中，在大型傷口中心觀察到了罕見的 HF 再生能力。有人提出，免疫細胞（主要是巨噬細胞、T 細胞）可能是選擇性促進瘢痕形成或再生 WIHN 的傷口愈合的關鍵協(xié)調(diào)者，而免疫系統(tǒng)的空間異質(zhì)性仍不清楚。之前的研究表明，ECM 支架能夠增強 HF 的再生以及免疫調(diào)節(jié)作用。然而，由生物材料引發(fā)的異物反應（FBR）和對皮膚細胞的特異性免疫調(diào)節(jié)作用仍然難以捉摸。在這項研究中，首先在大面積（直徑 = 1.5cm）夾板切除傷口愈合模型中重復了 WIHN 現(xiàn)象，其標志是傷口中心的從頭 HF 再生。接下來展示了 ECM 支架對增強的 WIHN 發(fā)揮了進一步的促再生作用，無論傷口大小。包括 scRNA-seq 和 ST 在內(nèi)的多組學方法被用于描述傷口愈合過程中免疫微環(huán)境的微妙空間特征。綜合分析強調(diào)了 T 細胞、單核細胞和促炎巨噬細胞 (PIM) 與支架周圍的 HF 前體細胞共定位的優(yōu)先聚集。它們之間豐富的局部細胞間通訊表明適應性免疫系統(tǒng)在 HF 再生中具有治療潛力。缺乏 HF 再生能力的 Rag2-/- 小鼠提供了進一步的證據(jù)，證明生物材料激活的適應性免疫系統(tǒng)對于無疤痕傷口愈合至關重要。
WIHN occurred in large wound center with activation of adaptive immune system
在小鼠切除傷口愈合模型中創(chuàng)建了小面積和大面積（直徑從 0.6 厘米到 1.5 厘米）圓形傷口。比較不同傷口大小的新生HF數(shù)，證實WIHN發(fā)生在大傷口（直徑=1.5cm）中心，而小傷口（直徑<1.5cm）愈合，具有無真皮附件的纖維化瘢痕特征。為了探索刺激WIHN的潛在機制，分別創(chuàng)建了不同傷口大小的Ctrl_SW（直徑=0.6cm）和Ctrl_LW（直徑=1.5cm）組，并采集傷口組織進行進一步檢查。與小傷口相比，大傷口顯示出富含毛囊發(fā)育和αβT細胞分化的基因表達上調(diào)。相關熱圖顯示HF再生相關基因與適應性免疫反應相關基因之間呈正相關。免疫熒光 (IF) 染色和流式細胞術證實大傷口（尤其是傷口中心）保持大量的適應性 T 細胞浸潤。
Integration of spatial transcriptomics and scRNA-seq profiling
為了探索傷口愈合過程中單細胞的空間特征，應用 ST 和 scRNA-seq 來分析大小傷口的空間基因表達譜?；赟T剖面，可以清楚地區(qū)分傷口的解剖結構?；蚋患治霰砻鳎珻trl_LW樣本上調(diào)了與毛囊形態(tài)發(fā)生和抗原呈遞相關的基因。成纖維細胞亞群的異質(zhì)性可以解釋為什么小傷口通常會在沒有 HF 的瘢痕下愈合的原因。根據(jù)之前的報道，小傷口真皮修復的主要初始波是由下層成纖維細胞介導的，包括 LF (49.88%) 和 RF (21.93%)，這與皮下組織和真皮中的膠原蛋白沉積有關。相比之下，大傷口有更多的上譜系PF（36.11％）。 PF 由 2 個subclusters組成，包括 PF1 (Runx1+Inhba+) 和 PF2 (Notch1+Prdm1+)，它們都被認為具有支持 HF 啟動的能力。來自 scRNA-seq 的成纖維細胞特征基因在空間分布表明，PF（HF 相關）在大傷口中心內(nèi)表現(xiàn)出強烈的空間偏好。為了探索不同的免疫細胞類型如何有助于愈合過程，接下來評估了免疫細胞亞群的異質(zhì)性。 Ctrl_LW組的單核細胞(Mono)、抗炎巨噬細胞(AIM)和促炎巨噬細胞(PIM)較多。如圖 2G 所示，Mono、PIM 和 AIM 彌散分布在小傷口中，而 Mono（與抗原呈遞有關）和 PIM（與促炎途徑有關）顯示出在大傷口中心優(yōu)先聚集。此外，Ctrl_LW組顯示出更高比例的適應性T細胞。幾乎所有的 T 細胞亞群都只在大傷口中心表達。相比之下，小傷口似乎缺乏可觀察到的T細胞浸潤。綜上所述，在大傷口中觀察到PF（與HF再生有關）以及適應性T細胞、Mono和PIM的優(yōu)先聚集，這為它們之間潛在的細胞通信奠定了基礎。
Cellular communication landscape between immune cell and HF-related cutaneous cell
接下來，為了解決定義的細胞亞群之間的潛在相互作用，應用細胞通訊來預測配體/受體表達水平的細胞間通訊模式。通過比較相互作用強度（信息流），可以確定不同生物條件下信號通路的減少（關閉）或增加（開啟）。選擇了上調(diào)的通路并比較了表現(xiàn)出不同信號模式的配體受體的整體信號強度。包括 MHC-I、MHC-II 和 CD80 在內(nèi)的適應性免疫系統(tǒng)相關通路僅在大傷口中富集。大傷口中免疫細胞和皮膚細胞之間的主要信號傳導是由PF介導的（與HF再生有關）。如圖 3D 所示，適應性免疫細胞和毛囊前體細胞富含相互作用的配體或受體基因伴侶，例如 Il6/Il6st、Inhba/Acvr1b。空間圖顯示 Il6 和 Inhba 在大傷口中優(yōu)先聚集。已經(jīng)報道了激活素和 Il6 途徑在 HF 再生中的重要作用。研究結果表明，免疫細胞，尤其是 T 細胞、Mono 和 PIM 可能通過 IL-6 和激活素等信號通路調(diào)節(jié) PF、毛囊祖細胞 (HFP) 和毛囊干細胞 (HFSC) 的狀態(tài)。
Enhanced WIHN occurred in scaffold-implanted wound with the further activation of adaptive immune system
合成移植是治療嚴重大面積皮膚創(chuàng)面的有效方法之一，尤其是在患者donor不合格的情況下。隨著對組織工程的深入了解，建議合成生物材料模仿天然ECM結構的天然結構可以整合并發(fā)揮潛在的促進傷口愈合的作用。之前的報告已經(jīng)說明了 ECM 支架在小傷口（直徑=0.6cm）愈合中的免疫調(diào)節(jié)作用。接下來在有/沒有植入生物材料的 C57BL/6 小鼠中重復大型全層傷口愈合模型，以研究是否在 ECM 支架處理的傷口中觀察到進一步的再生現(xiàn)象。圖 4A 總結了評估大傷口愈合的工作流程。在ECM_LW組的全層切除傷口（直徑，1.5 cm）下方放置了ECM支架，而Ctrl_LW組不接受任何材料。 ECM_LW 組的傷口覆蓋更快，并且 ECM_LW 的間隙寬度也更小。細胞角蛋白5（Krt5）和細胞角蛋白10（Krt10）的IF染色顯示生物材料周圍有角化細胞，ECM_LW組新上皮面積更大。如圖 4F 所示，植入大傷口的 ECM 膜沒有觸發(fā)明顯的纖維包膜。該支架在體內(nèi)具有快速的降解速率。分析可以觀察到POD 14上的降解碎片和POD21上的降解顆粒，POD28上沒有任何可見的殘留物。此外，在 ECM_LW 組中可以識別出 HF 形態(tài)發(fā)生的輪廓：在 POD7 上首次出現(xiàn)在毛胚階段，它們逐漸長成球莖-釘狀結構，覆蓋在 POD21 上的降解支架碎片上。在 POD28 上，發(fā)現(xiàn) ECM_LW 組重現(xiàn)了正常皮膚結構，具有相同數(shù)量的成熟附件和“籃波”ECM 膠原蛋白沉積?？傊谛∈蟠笮腿珜觽谀Ｐ椭?，生物材料導致傷口愈合更快并增強了 HF 的再生。膜優(yōu)異的生物相容性和可降解性也避免了進一步臨床應用中免疫排斥和二次手術的風險。為了探索潛在的機制，注意到 ECM_LW 組顯示出與毛囊發(fā)育和 T 細胞分化有關的基因富集增加。 IF & IHC 染色和流式細胞術證實植入的生物材料周圍的 T 細胞浸潤增加。
Integration of ST and scRNA-seq illustrated the cell heterogeneity around biomaterials
為了探索支架植入傷口中細胞異質(zhì)性的空間特征，還應用 ST 和 scRNA-seq 來分析空間基因表達譜。解剖結構也可以在 ST 切片中識別，ECM_LW 顯示毛囊形態(tài)發(fā)生中的基因富集以及適應性免疫反應?；?scRNA-seq 分析，ECM_LW 組顯示出更高比例的 HF 相關成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞。空間特征圖顯示了植入的生物材料周圍的角質(zhì)形成細胞。此外，觀察到 ECM_LW 組上譜系 PF（與 HF 再生有關）的分布擴大。相比之下，包括 RF 和 LF（與膠原沉積相關）在內(nèi)的較低譜系成纖維細胞顯著減少，這表明不同的愈合結果。雖然通常在未植入的大傷口（POD14~21）傷口閉合后幾天才開始HF形成過程。在 POD7 上 ECM_LW 組的 ST 分析中，我們可以識別出由新表皮中的 Krt28+HFP 和真皮下方的 Twis2+ Dermal condensate (Dc) 聚集組成的 HF 的初始結構，這突出了 ECM_LW 組中的早期 HF 形成特征。空間基因表達水平。為了探索支架誘導的免疫微環(huán)境，我們接下來將免疫細胞的標記基因與 ST 分析相結合。 ST 截面中每個簇的空間圖如圖 5H 和 5I 所示。分析注意到膜周圍的 MAC 明顯聚集。 T細胞在biom周圍的擴大分布。值得注意的是，觀察到組織駐留 ILC 在上皮以及肉芽組織中的積累，特別是在 ECM_LW 組中。上皮附近的 ILC 可能增強與 HFSC 或 HFP 細胞的細胞通訊，從而有助于 HF 的形成?；诙嗄B(tài)分析，仍然觀察到 T 細胞、PIM 和 Mono 與 ECM_LW 組中的 HF 前體細胞的重疊分布，這暗示了它們之間潛在的細胞通信。
Prediction of critical signaling patterns between spatially colocalized cell populations of ECM_LW and Ctrl_LW
接下來，還應用 Cell Chat 來預測 EMC_LW 和 Ctrl_LW 之間的細胞間通信模式。熱圖顯示了Ctrl_LW和ECM_LW組配體受體的整體信號強度。包括MHC-II在內(nèi)的適應性免疫系統(tǒng)相關通路在ECM_LW中被激活。除 IL6 外，在 ECM_LW 組中，F(xiàn)GF、Notch、KIT 等胚胎 HF 發(fā)育中的關鍵信號也上調(diào)。值得注意的是，T 細胞亞群（尤其是 ILC）和 HF 前體細胞富含相互作用的受體/配體基因pairs，包括 Areg-（Egfr+Erbb2）、Epgn-Egfr。已預測 Egf 通路在胚胎性皮膚形態(tài)中的關鍵功能，并且認為表皮生長因子受體 (Egfr) 的表達對于 Treg 細胞促進皮膚傷口愈合至關重要。根據(jù)我們的分析，T 細胞（尤其是 ILC）可能通過 EGF 和 EGPN 途徑調(diào)節(jié) HF 前體細胞的生長，從而促進 HF 的形成。此外，如圖 6E 所示，我們觀察到免疫細胞（巨噬細胞和 T 細胞亞群）和 HF 前體細胞富含相互作用的受體或配體基因伴侶，包括 Mdk-（Sdc1 或 Itgb1）、Ptn-（Itgb1 或 Sdc1） .強調(diào)多效素（PTN）和中期因子（MK）通路在小鼠表皮分層事件中的作用發(fā)生在E13.5和E14.5之間。根據(jù)我們的預測，HF前體細胞可以通過區(qū)域細胞通訊反向介導免疫細胞的激活例如 Mk 和 Ptn 通路。為了證明適應性免疫系統(tǒng)在 HF 再生中的作用，我們將 ECM 支架放置在缺乏成熟淋巴細胞的免疫缺陷 C57Bl/6 (B6.129-Rag2tm1) 小鼠的背側皮膚大傷口中。我們注意到 Rag2-/- 小鼠 (Rag2-/-) 的傷口閉合率延遲。 Rag2 - / - 小鼠中HF的再生很少。與募集 Cd3+ T 細胞的 WT 小鼠相比，在 Rag2-/- 小鼠中觀察到 Ly6g+ 中性粒細胞。
Biomaterials facilitated the de novo HF regeneration despite of wound size
為了檢測用生物材料治療的小傷口和大傷口之間的傷口愈合是否仍有差異，接下來重復了植入生物材料的小（直徑=0.6cm）和大（直徑=1.5cm）全層傷口。與 ECM_LW 組一致，植入小傷口的對齊膜也沒有觸發(fā)明顯的 FBR 纖維囊。小傷口和大傷口之間支架周圍的纖維囊厚度沒有顯著差異。支架在小傷口中仍具有較快的降解率?？梢宰R別 POD14 上的降解片段，并且 POD28 上沒有任何可見的殘留物。 ECM_SW 組織的組織切片也顯示出明顯的 WIHN 增強跡象：在 POD14 上，小傷口的新上皮呈球狀，下面有幾個表皮囊腫，而真皮更厚，包裹著降解的支架碎片。隨后，我們觀察到成熟的 HF 在 POD28 上具有 SG。同樣，ECM_SW 組的新生毛囊呈鋸齒形，沒有色素沉著。兩組平均 HF 數(shù)的差異也沒有統(tǒng)計學意義?；?bulk-seq 分析，熱圖顯示與 HF 再生、適應性免疫反應或先天免疫反應相關的基因表達變化不大。 Cd3 和 Cd68 的 IHC 染色證實了支架周圍或肉芽組織中 T 細胞和巨噬細胞的相似浸潤水平。我們使用 scRNA-seq 進一步探索了免疫細胞組成的差異。巨噬細胞的總比例在兩組之間是平衡的，ST profiling 的綜合分析顯示支架周圍三個亞群的分布相似。盡管 T 細胞亞群組成略有不同，但多模式分析證實了兩組支架周圍所有 T 細胞亞群的實質(zhì)性分布?？傊?，根據(jù)評估，無論傷口大小，生物材料對愈合顯示出類似的“促再生”效果。此外，對適應性免疫系統(tǒng)的類似免疫調(diào)節(jié)作用表明局部免疫環(huán)境在HF再生中的重要作用。
Discussion
傷口閉合延遲、易感染、附肢不能再生等問題已成為皮膚傷口愈合的主要障礙。對適當?shù)纳锵嗳菪?、可降解性和加速上皮化以及促進新生 HF 形成的能力的要求給生物材料設計帶來了重大挑戰(zhàn)，特別是對于大規(guī)模全層傷口。 WIHN 是一種罕見的成年小鼠哺乳動物器官再生模型，其中大的全層傷口 (>1cm2) 僅在傷口中心誘導很少的新生 HF 再生。當 HFP 和 HFSC 與新上皮一起遷移并誘導 Dc（源自 PF）在它們下方聚集時，HF 形態(tài)發(fā)生的開始開始。已經(jīng)強調(diào)了免疫系統(tǒng)在協(xié)調(diào)傷口修復的早期階段的促再生影響。然而，特定免疫亞簇和 HF 前體細胞之間的細胞相互作用仍不清楚。在這里，首先比較了總“疤痕”（小傷口，直徑 = 0.6cm）和“半再生”WIHN（大傷口，直徑= 1.5 厘米）模型。對小 (Ctrl_SW) 和大傷口 (Ctrl_LW) 樣本的多模式分析中，我們觀察到來自 Ctrl_LW 組的適應性免疫細胞比例較高，它們位于大傷口中心和邊緣，與 HF 前體細胞共定位。它們之間活躍的區(qū)域細胞-細胞通訊表明適應性免疫細胞在促進 HF 新生中的“促再生”作用，并為免疫調(diào)節(jié)材料在皮膚傷口再生中的應用提供了有希望的治療靶點。接下來，使用 ECM 支架治療大面積皮膚缺損，并研究其在傷口愈合和免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)中的作用。支架顯示出對加速傷口閉合和促進新生 HF 形成的影響。結果表明，生物材料對適應性免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用。分析發(fā)現(xiàn)，響應支架植入的大量 T 細胞浸潤被驅動向再生亞群，與豐富的 PF（與 HF 再生有關）重疊。擴大的“促再生”免疫生態(tài)位與 HF 前體細胞之間的局部細胞間通訊支持了適應性系統(tǒng)在 HF 再生中的重要作用。最后，證實了支架在大小傷口修復中的促再生作用。支架對 T 細胞的募集具有相似的作用。同時，支架周圍的溫和FBR降低了免疫排斥的風險，適當?shù)慕到饴室部梢员苊舛问中g的額外費用?？傊?，當傷口在頭發(fā)周期的休止期/退行期產(chǎn)生時再生。 WIHN模型中黑色素細胞的活性值得后續(xù)探索。
Methods(關注一下重點方法)
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