導(dǎo)讀

研究者通過共識(shí)對(duì)接和 MM-PBSA 計(jì)算，發(fā)現(xiàn)某些呋喃蛋白酶天然產(chǎn)物抑制劑具有抗擊新冠病毒的潛力。

• ?? 呋喃蛋白酶被認(rèn)為是 SARS-CoV-2 的潛在治療靶標(biāo)。
• ?? 研究者利用 HYBRID 和 AutoDock Vina 軟件，對(duì) 3942 種非洲天然產(chǎn)品化合物進(jìn)行了虛擬篩選。
• ?? 從中篩選出 20 種化合物，作為潛在的候選先導(dǎo)化合物。
• ?? 這些化合物展現(xiàn)出了良好的抑制活性和藥代動(dòng)力學(xué)/毒理學(xué)特性。

該研究采用共識(shí)對(duì)接方法，結(jié)合 HYBRID 和 AutoDock Vina 軟件，針對(duì)人類呋喃蛋白酶（PDB: 4RYD）對(duì) 3942 種源自非洲的天然產(chǎn)物化合物進(jìn)行了虛擬篩選。

在分子對(duì)接、構(gòu)象對(duì)齊檢查和呋喃-配體相互作用方面符合標(biāo)準(zhǔn)的 20 種化合物被選作候選先導(dǎo)化合物。ROC 計(jì)算得到的 AUC 值為 0.72，以及 Boltzmann 增強(qiáng)的 ROC 曲線（BEDROC）值為 0.65，顯示 AutoDock Vina 是篩選此靶標(biāo)活性化合物的有效工具。

其中 7 種化合物被提議作為潛在先導(dǎo)化合物，它們與催化三重組 Ser368、His194 和 Asp153 以及活性位點(diǎn)的其他關(guān)鍵殘基具有結(jié)合作用，其 MM-PBSA 計(jì)算的結(jié)合自由能在-189 至-95 kJ/mol 之間，表現(xiàn)出良好的 ADME/毒理學(xué)屬性。

這些分子還被預(yù)測(cè)具有抗病毒、抗炎、膜通透性抑制、RNA 合成抑制、細(xì)胞保護(hù)和肝臟保護(hù)作用，其潛在活性值（Pa）高于 0.5，潛在無(wú)效值低于 0.1。

其中一些分子還具有抗流感活性。流感病毒與 SARS-CoV-2 在進(jìn)入人體細(xì)胞的方式上有諸多相似之處，均通過呋喃蛋白酶促進(jìn)。其中一種潛在先導(dǎo)化合物，蜂膠化合物的 Pinobanksin 3-(E)-caffeate，在先前的研究中已顯示出對(duì) SARS-CoV-2 的 ACE2、TMPRSS2 和 PAK1 信號(hào)通路具有抑制作用。同樣，槲皮素與目前正在進(jìn)行 COVID-19 臨床試驗(yàn)的異槲皮素在結(jié)構(gòu)上具有相似性。

共識(shí)對(duì)接方法

在此研究中，研究者使用 OEDocking HYBRID 和 AutoDock Vina 來評(píng)估來自非洲天然來源的化合物。關(guān)鍵是識(shí)別那些結(jié)合能量為-7 kcal/mol 或更低的化合物，表明它們可能抑制 furin 蛋白酶。

天然產(chǎn)物庫(kù)

來自非洲數(shù)據(jù)庫(kù)的來源

利用了來自北非天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)（NANPDB）、東非天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)（EANPDB）和 AfroDb 數(shù)據(jù)庫(kù)的 7391 種天然化合物庫(kù)。

過濾過程

過濾軟件 FILTER 在精煉這個(gè)庫(kù)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。它排除了具有非藥物樣性質(zhì)、毒性或非先導(dǎo)樣特性的化合物，留下了 3942 個(gè)可用于進(jìn)一步分析的候選物。

Furin 蛋白酶的結(jié)構(gòu)

晶體結(jié)構(gòu)分析

人類 furin 蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID: 4RYD），揭示了有關(guān)蛋白質(zhì)活性部位的關(guān)鍵信息，并在隨后的對(duì)接研究中發(fā)揮了重要作用。

驗(yàn)證對(duì)接工具

確保準(zhǔn)確性

在進(jìn)行虛擬篩選之前，對(duì)接工具 HYBRID 和 AutoDock Vina 經(jīng)過了驗(yàn)證。這個(gè)過程涉及評(píng)估它們?cè)诟患唤M已知 furin 抑制劑和誘餌活性化合物方面的性能。

虛擬篩選過程

第一階段：使用 HYBRID

研究者使用 HYBRID 工具將預(yù)過濾的化合物庫(kù)對(duì)接到蛋白質(zhì)的活性部位，并使用 Chemgauss4 評(píng)分函數(shù)進(jìn)行評(píng)估。

第二階段：使用 AutoDock Vina

同時(shí)，使用 AutoDock Vina 將同一化合物庫(kù)對(duì) furin 蛋白酶進(jìn)行篩選，使用特定的網(wǎng)格箱尺寸定義蛋白質(zhì)的活性部位。

選擇潛在的先導(dǎo)化合物

選擇標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)它們的對(duì)接分?jǐn)?shù)、構(gòu)象比較分析中的對(duì)齊以及它們與蛋白質(zhì)活性部位關(guān)鍵殘基的相互作用來選擇化合物。

評(píng)估穩(wěn)定性和結(jié)合自由能

分子動(dòng)力學(xué)模擬

對(duì)選定的先導(dǎo)化合物進(jìn)行了 100 ns 的分子動(dòng)力學(xué)模擬，使用 GROMACS 評(píng)估它們與 furin 蛋白酶的相互作用穩(wěn)定性。

MM-PBSA 計(jì)算

然后采用分子力學(xué)泊松-玻爾茲曼表面面積（MM-PBSA）計(jì)算，以確定這些蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的結(jié)合自由能。

進(jìn)一步分析和預(yù)測(cè)

結(jié)構(gòu)相似性和活性預(yù)測(cè)

研究者對(duì)識(shí)別的命中化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)相似性搜索，并使用物質(zhì)活性譜預(yù)測(cè)（PASS）工具估計(jì)它們的生物活性。

ADME/Tox 特性分析

使用各種計(jì)算工具對(duì)先導(dǎo)化合物的吸收、分布、代謝、排泄和毒性（ADME/Tox）特性進(jìn)行了概況，以預(yù)測(cè)它們的藥代動(dòng)力學(xué)特性和潛在毒性。

主要結(jié)果與圖表

圖 1：研究方法的逐步展示

本研究采用分子對(duì)接技術(shù)，從非洲天然產(chǎn)品數(shù)據(jù)庫(kù)（ANPDB）篩選天然產(chǎn)物，針對(duì) Furin 蛋白酶進(jìn)行研究。接著，通過分子動(dòng)力學(xué)（Molecular Dynamics）模擬分析這些分子間的相互作用，并預(yù)測(cè)其生物活性。所用技術(shù)還包括分子力學(xué)-泊松-玻爾茲曼表面積法（MM-PBSA）、物質(zhì)活性譜預(yù)測(cè)（PASS），以及吸收、分布、代謝、排泄和毒性（ADMET）分析。

圖 2：AutoDock Vina 對(duì) Furin 蛋白酶的 ROC AUC 評(píng)估

使用 AutoDock Vina 對(duì) 52 種活性化合物和 224 個(gè)對(duì)照物進(jìn)行篩選，并對(duì) Furin 蛋白酶進(jìn)行評(píng)估，得出的 AUC 值為 0.72。

圖 3：結(jié)合配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)

展示了與 Furin 蛋白酶結(jié)合的配體 para-guanidinomethyl-Phac-R-Tle-R-Amba（MI-1148）的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖 4：Furin 蛋白酶結(jié)合口袋

（A）展示了 Furin 蛋白酶的活性位點(diǎn)區(qū)域，其中 S1、S2、S3、S4 和 S5 標(biāo)簽指示活性配體可能占據(jù)的位置。S1 和 S2 區(qū)域包含催化三元組 Ser368（綠色）、His194（黃色）和 Asp153（紫色），這些是潛在抑制劑最常結(jié)合的區(qū)域。（B）活性位點(diǎn)的催化三元組以棍棒模型展示。

圖 5：潛在先導(dǎo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

展示了針對(duì) Furin 蛋白酶預(yù)測(cè)的幾種潛在先導(dǎo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

• （A）槲皮素（Quercitrin）。
• （B）Teucrol。
• （C）Malvinidin-3-arabinoside。
• （D）N-E-caffeoyl tyramine。
• （E）Pinobanksin 3-(E)-caffeate。
• （F）Abyssinone IV。
• （G）ZINC000085967772。

圖 6：選定潛在先導(dǎo)化合物的構(gòu)象

研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)化合物能夠結(jié)合在含有催化殘基的 S1 和 S2 區(qū)域。例如，Abyssinone IV 和 Quercitrin 與 His194 和 Ser368 的催化殘基形成了氫鍵或疏水相互作用。與配體形成氫鍵的殘基用黑色標(biāo)記，疏水相互作用的殘基用紅色標(biāo)記。這些圖像由 PyMOL（v 2.0.6）生成。

圖 7：Furin-配體復(fù)合物在 100 納秒模擬中的根均方偏差圖

在對(duì)骨架進(jìn)行最小二乘法（lsq）擬合后，所有潛在先導(dǎo)化合物在 MM-PBSA 計(jì)算中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的結(jié)合力，結(jié)合自由能得分為-172.892 ± 24.913 kJ/mol（表 3 和圖 9）。所有其他潛在先導(dǎo)化合物的結(jié)合自由能也表現(xiàn)合理（表 3），與它們?cè)诜肿訉?duì)接后獲得的結(jié)合親和力良好相關(guān)。

之前的研究探討了 Furin 蛋白與葉酸和葉酸鈣兩種配體之間的分子相互作用，使用 MM-PBSA 方法進(jìn)行研究。葉酸和葉酸鈣的結(jié)合自由能分別為-27.90 和-12.84 kcal/mol，雖與本研究觀察到的 Furin 蛋白酶的相互作用殘基不同，但本研究中預(yù)測(cè)的化合物對(duì) Furin 蛋白酶的親和力高于這兩種葉酸類似物。

圖 8：Furin-配體復(fù)合物在 100 納秒模擬中的回轉(zhuǎn)半徑圖

圖 9：MM-PBSA 計(jì)算中潛在先導(dǎo)化合物的蛋白-配體復(fù)合物的結(jié)合自由能

圖 10：通過 SwissADME 預(yù)測(cè)的潛在先導(dǎo)化合物的 ADME 特性

圖中展示了使用 SwissADME 預(yù)測(cè)的幾種潛在先導(dǎo)化合物的 ADME 特性。

• （A）槲皮素（Quercitrin）。
• （B）Teucrol。
• （C）Malvinidin-3-arabinoside。
• （D）N-E-caffeoyl tyramine。
• （E）ZINC000085967772。
• （F）Pinobanksin 3-(E)-caffeate。
• （G）Abyssinone IV。

表格 1：人類 Furin 蛋白酶潛在活性化合物分析

展示了通過共識(shí)分子對(duì)接篩選出的前 20 種潛在活性化合物，并列出了它們?cè)?HYBRID 和 AutoDock Vina 分子對(duì)接中得到的結(jié)合能分?jǐn)?shù)。同時(shí)提供了基于構(gòu)象比較得到的 RMSD 值。

表格 2：潛在先導(dǎo)化合物與其氫鍵相互作用殘基

列出了潛在先導(dǎo)化合物及其通過氫鍵（H-bond）相互作用的殘基，并顯示了它們通過 AutoDock Vina 獲得的結(jié)合能量，與作為對(duì)照的 MI-1148 相當(dāng)。

表格 3：潛在先導(dǎo)化合物的能量貢獻(xiàn)估算

展示了通過分子力學(xué)/泊松-玻爾茲曼表面積（MM-PBSA）計(jì)算估算的潛在先導(dǎo)化合物的能量貢獻(xiàn)。能量值以平均值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

表格 4：潛在先導(dǎo)化合物的 ADMET 性質(zhì)預(yù)測(cè)

利用 pkCSM 服務(wù)器預(yù)測(cè)潛在先導(dǎo)化合物的 ADMET 屬性。

表格 5：潛在先導(dǎo)化合物的毒性預(yù)測(cè)

利用 Protox-II 對(duì)潛在先導(dǎo)化合物的毒性進(jìn)行預(yù)測(cè)。

缺點(diǎn):

• 缺乏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：
• 研究過度依賴計(jì)算預(yù)測(cè)，未對(duì)提出的抑制劑進(jìn)行體外或體內(nèi)驗(yàn)證。
• 存在計(jì)算模型無(wú)法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)化合物在現(xiàn)實(shí)中的效果或毒性的風(fēng)險(xiǎn)。
• 數(shù)據(jù)解讀和結(jié)論：
• 在沒有實(shí)驗(yàn)支持的計(jì)算方法限制下，得出的結(jié)論可能過于樂觀。
• 研究可能忽視了潛在的非靶標(biāo)效應(yīng)或毒性問題，因?yàn)橹攸c(diǎn)放在了計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)上。

改進(jìn)建議

• 加入實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：

• 對(duì)識(shí)別出的化合物進(jìn)行體外和/或體內(nèi)測(cè)試，以驗(yàn)證計(jì)算預(yù)測(cè)并評(píng)估其現(xiàn)實(shí)世界的效果。
• 研究頂級(jí)化合物的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)，以更全面地評(píng)估。

• 擴(kuò)展數(shù)據(jù)解讀：

• 討論計(jì)算方法的局限性，避免在沒有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的情況下過度解讀結(jié)果。
• 探討潛在的非靶標(biāo)效應(yīng)和毒性問題，提供對(duì)發(fā)現(xiàn)的更平衡的觀點(diǎn)。

• Dankwa, B., Broni, E., Enninful, K. S., Kwofie, S. K., & Wilson, M. D. (2022). Consensus docking and MM-PBSA computations identify putative furin protease inhibitors for developing potential therapeutics against COVID-19. Structural Chemistry, 33(6), 2221–2241. https://doi.org/10.1007/s11224-022-02056-1

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