原理

結(jié)合態(tài)淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase，GBSS，EC 2.4.1.21）以束縛態(tài)存在于淀粉體中，催化淀粉鏈的加長(zhǎng)反應(yīng)，主要負(fù)責(zé)直鏈淀粉的合成。CheKine? 結(jié)合態(tài)淀粉合成酶（GBSS）活性檢測(cè)試劑盒（微量法）可檢測(cè)植物組織樣本。在該試劑盒中，GBSS催化ADPG與淀粉引物(葡聚糖)反應(yīng)，將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上，同時(shí)生成ADP；進(jìn)一步通過(guò)反應(yīng)體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化NADP+還原為NADPH，其中NADPH生成量與前一步反應(yīng)生成的ADP數(shù)量呈正比，通過(guò)340 nm下測(cè)定NADPH的增加量，可以計(jì)算GBSS活性。

自備耗材

·酶標(biāo)儀或紫外光分光光度計(jì)（能測(cè)340 nm處的吸光度）

·96孔UV板或微量石英比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭、1.5 mL離心管

·水浴鍋、低溫離心機(jī)

·去離子水

·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）

試劑準(zhǔn)備

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。

注意：Extraction Buffer有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。

Working Reagent II：臨用前配制；Reagent II A 48 T加入8.4 mL ReagentⅠ，96 T加入16.8 mL ReagentⅠ，緩慢加熱，逐漸升溫至煮沸使其溶解，冷卻后與Reagent II B和Reagent II C混勻溶解待用。用不完的試劑-20℃避光分裝保存2周，避免反復(fù)凍融。

Reagent III：臨用前配制；48 T加入4.8 mL ReagentⅠ，96 T加入9.6 mL ReagentⅠ，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融。

Reagent IV：臨用前配制；48 T加入6 mL ReagentⅠ，96 T加入12 mL ReagentⅠ，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融。

Reagent V：臨用前配制；48 T加入0.225 mL去離子水，96 T加入0.45 mL去離子水，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融。

Reagent VI：臨用前配制；48 T加入0.225 mL去離子水，96 T加入0.45 mL去離子水，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融。

樣本制備

注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個(gè)月。測(cè)定時(shí)，應(yīng)控制解凍的溫度和時(shí)間。室溫環(huán)境下解凍時(shí)，需在4 h內(nèi)完成樣品解凍。

植物組織：稱取約0.1 g樣本，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴勻漿，10,000 g，4℃離心10 min，棄上清液，在沉淀中加入1 mL Extraction Buffer充分混勻，置冰上待測(cè)。

注意：如需測(cè)定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號(hào)：KTD3002的蛋白質(zhì)定量試劑盒（Bradford法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.酶標(biāo)儀或紫外光分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm，紫外光分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。

2.操作表（下述操作在1.5 mL EP管中操作）：

試劑測(cè)定孔（μL）

樣本75

Working Reagent?II135

混勻，30℃保溫20 min，置沸水浴中1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻

Reagent?III75

混勻，30℃保溫30 min，置沸水浴中1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻，10,000g，4℃離心10?min，取上清液。下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中操作：

上清液150

Reagent?IV100

Reagent?V5

Reagent?VI5

3.充分混勻，立即記錄340 nm處10 s時(shí)吸光值A(chǔ)1和130 s時(shí)的吸光值A(chǔ)2。計(jì)算ΔA=A2-A1。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA小于0.02可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA大于0.6，樣本可用Extraction Buffer進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。若ΔA出現(xiàn)負(fù)值，則說(shuō)明樣本中不含GBSS或已降解。

結(jié)果計(jì)算

注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過(guò)程計(jì)算公式和簡(jiǎn)潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡(jiǎn)潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。

GBSS活性的計(jì)算

A.使用96孔UV板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活單位定義：每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

GBSS (U/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T×1.9=1,059×ΔA÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算：

酶活單位定義：每克樣本每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

GBSS (U/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T×1.9=1,059×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.6×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L /mol /cm；d：96孔UV板光徑，0.5 cm；V樣：加入樣本體積，0.075 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；1.9：稀釋倍數(shù)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

B.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式

將上述計(jì)算公式中光徑d：0.5 cm調(diào)整為d：1 cm進(jìn)行計(jì)算即可。

結(jié)果展示

以下數(shù)據(jù)僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

Figure 1. 本試劑盒測(cè)定南瓜和玉米種子中GBSS的活性。