密碼子優(yōu)化

密碼子優(yōu)化，指的是利用偏愛密碼子（Preferred codons)，即避免利用率低的稀有密碼子，簡化基因轉(zhuǎn)錄后mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，去除不利于高效表達(dá)的模體（Motif），加入有利于高效表達(dá)的模體，調(diào)整GC含量等這些方法重新設(shè)計(jì)基因。基因合成的商業(yè)化大大推動(dòng)了密碼子優(yōu)化的適用范圍和影響力。

基因的最優(yōu)表達(dá)是通過對(duì)基因本身、載體、宿主系統(tǒng)、培養(yǎng)條件的系統(tǒng)性設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)的。普通科研工作者常規(guī)關(guān)注要點(diǎn)是選擇合適的表達(dá)載體和宿主系統(tǒng)，而往往忽視基因本身是否與載體和宿主系統(tǒng)達(dá)到最佳匹配。泓迅利用多年的合成生物學(xué)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)基因和載體的設(shè)計(jì)優(yōu)化我們關(guān)注以下幾個(gè)重要方面：

1. 密碼子偏好性

不同物種對(duì)同義密碼子的使用頻率是不同的，而這種密碼子偏好性對(duì)翻譯過程有影響。如果一條mRNA有很多成簇的稀有密碼子，這會(huì)對(duì)核糖體的運(yùn)動(dòng)速度造成負(fù)面影響，大大降低蛋白表達(dá)水平。若是在基因的同義密碼子使用頻率與表達(dá)宿主相匹配的情況下，蛋白的表達(dá)水平則會(huì)顯著提高。匹配程度常用密碼子適應(yīng)指數(shù) （Codon Adaption Index）來表示，通常情況下，CAI≥0.80被認(rèn)為是預(yù)測重組蛋白高效表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)。

除了密碼子的偏好性外，還需要考慮密碼子的組合使用效率。亦即，在大部分情況下，僅用高頻密碼子的效果并不會(huì)最好，考慮到高頻和次高頻密碼子的組合使用效果會(huì)更佳。泓迅擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的NG? Codon優(yōu)化軟件是業(yè)內(nèi)在這方面的首創(chuàng)。

2. mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)是影響翻譯過程的另一重要因素，復(fù)雜穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)阻礙翻譯過程的順利進(jìn)行，特別是核糖體綁定位點(diǎn) （RBS）附近的二級(jí)結(jié)構(gòu)。mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在DNA序列中主要表現(xiàn)為發(fā)卡結(jié)構(gòu)（Hairpin），有效識(shí)別并盡可能的減少發(fā)卡結(jié)構(gòu)是密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)劣的重要判斷標(biāo)準(zhǔn)。

3. 影響表達(dá)的反式作用元件和限制性酶切位點(diǎn)的去除

優(yōu)化過程不僅需要考慮到對(duì)翻譯有積極影響的元件/序列，還需要考慮到對(duì)轉(zhuǎn)錄和翻譯有消極影響的元件/序列。任何對(duì)于轉(zhuǎn)錄和翻譯有消極作用的反式作用元件需要通過密碼子優(yōu)化軟件去除以消除轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中的多重障礙。

限制性酶切位點(diǎn)需要根據(jù)克隆策略進(jìn)行個(gè)性化排除，以免酶切位點(diǎn)產(chǎn)生沖突，影響構(gòu)建表達(dá)載體的操作。

4. GC含量

AT間存在2個(gè)氫鍵，GC間存在3個(gè)氫鍵，所以GC含量直接影響著DNA序列的結(jié)合穩(wěn)定性和退火溫度。在啟動(dòng)子等保守區(qū)域GC含量相對(duì)較高。另外，GC含量也影響著mRNA熱力學(xué)穩(wěn)定性及mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。

5. 翻譯起始與終止效率

蛋白穩(wěn)定性、mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率對(duì)蛋白產(chǎn)量和可溶性起主要作用。翻譯過程分為起始、延伸和終止三個(gè)期。

首先，起始階段的順利進(jìn)行決定了蛋白質(zhì)表達(dá)量從無到有。對(duì)于翻譯的起始，原核mRNA需要5’端非翻譯前導(dǎo)序列中有一段叫Shine-Dalgarno序列的特異核糖體結(jié)合序列。在真核細(xì)胞，有效的起始依賴于圍繞在起始密碼子ATG上下游的一段叫Kozak序列的序列。高效的延伸階段決定了蛋白質(zhì)能夠積累的量。這個(gè)在前面的密碼子偏好性及二級(jí)結(jié)構(gòu)和反式作用元件等篇章已經(jīng)詳細(xì)討論過。翻譯終止是蛋白生命周期必須的一步，卻最容易被忽略?？茖W(xué)研究表明終止效率對(duì)蛋白表達(dá)水平有很大的影響，更有效的翻譯終止會(huì)促進(jìn)蛋白表達(dá)。絕大多數(shù)生物都有偏愛的圍繞終止密碼子的序列框架，例如酵母和哺乳動(dòng)物偏愛的終止密碼子分別是UAA和UGA，單子葉植物最常利用UGA，而昆蟲和大腸桿菌傾向于用UAA。