The pan-cancer landscape of crosstalk between epithelial-mesenchymal transition and immune evasion relevant to prognosis and immunotherapy response
與預(yù)后和免疫治療反應(yīng)有關(guān)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和免疫逃逸之間的泛癌景觀
發(fā)表期刊：NPJ Precis Oncol
發(fā)表日期： 2021 Jun 22
doi:10.1038/s41698-021-00200-4
一、背景
????????上皮 - 間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程，其中它們從上皮形式過渡到間充質(zhì)形式，這在胚胎發(fā)生和組織修復(fù)中起著關(guān)鍵作用。EMT還參與人類惡性腫瘤并推動癌癥進(jìn)展，在EMT過程中，癌細(xì)胞的凋亡受到抑制，這有利于誘導(dǎo)癌癥干細(xì)胞，刺激血管生成，并增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制。此外，成功的 EMT 是在播散性腫瘤細(xì)胞和循環(huán)腫瘤細(xì)胞中觀察到的共同特征，這有助于癌癥的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。
????????臨床前和臨床數(shù)據(jù)表明，EMT是治療期間或治療后的常見現(xiàn)象，治療誘導(dǎo)的EMT意味著治療耐藥性和癌癥進(jìn)展。然而，對EMT與免疫療法之間關(guān)系的研究是有限的，免疫療法是一種有希望的癌癥治療策略，旨在增加浸潤免疫溶解細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。
二、材料與方法
1? 數(shù)據(jù)來源
1）從TCGA中獲得了相關(guān)的多組學(xué)數(shù)據(jù)，包括表達(dá)譜、外顯子測序數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)來自17種不同類型的實(shí)體癌的8200個腫瘤
2）從Van Allen, Alexandra Snyder, Aleix Prat, Nadeem Riaz和Willy Hugo收集了五個用免疫阻斷療法（ICB）（抗PD-1/PD-L1或抗CTLA4治療）治療的獨(dú)立免疫療法數(shù)據(jù)集，其中包括對非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）、HNSC、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和轉(zhuǎn)移性尿道癌（mUC）的治療
3）從Charoentong收集了28種免疫細(xì)胞類型的327個轉(zhuǎn)錄組
4）癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)從癌癥細(xì)胞系百科全書（CCLE）數(shù)據(jù)庫下載
5）在2018年5月至2020年9月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受腫瘤切除術(shù)的30名肺癌患者的肺癌組織
2? 分析流程
1）EMT和免疫逃逸之間的免疫調(diào)節(jié)串?dāng)_的定量模型：MT特征得分是基于比較145個上皮標(biāo)記基因和170個間質(zhì)標(biāo)記基因的表達(dá)；ECI得分>0的腫瘤（稱為ECI高的腫瘤）被認(rèn)為具有比基于相應(yīng)CYT水平的預(yù)期更高的EMT特征，而ECI<0的腫瘤（稱為ECI低的腫瘤）被認(rèn)為具有比基于相應(yīng)CYT水平的預(yù)期更低的EMT特征
2）腫瘤微環(huán)境中的免疫浸潤：Cibersort
3）確定與EMT和免疫規(guī)避之間的免疫調(diào)節(jié)串聯(lián)有關(guān)的癌細(xì)胞的分子和基因特征
4）免疫組化檢測
5）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：通過基因集富集分析（GSEA）對17種不同癌癥類型的標(biāo)志通路進(jìn)行富集；使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析了CYT依賴性和EMT依賴性的生存分析；通過ROC曲線評估腫瘤突變負(fù)荷（TMB）、EMT、CYT和ECI對免疫療法反應(yīng)的影響。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
01 - EMT和免疫逃逸之間的免疫調(diào)節(jié)串聯(lián)的系統(tǒng)性分析
????????作者首先研究了泛癌中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）和EMT特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在17種癌癥類型中存在明顯的正相關(guān)（補(bǔ)充圖1A）。然后測試了這種相關(guān)性是否混淆了癌癥亞型的識別，發(fā)現(xiàn)TILs比例較高的癌癥亞型表現(xiàn)出持續(xù)較高的EMT特征，盡管不同癌癥亞型的TILs浸潤水平存在明顯的差異（圖1A）。
????????細(xì)胞溶解免疫細(xì)胞是否與EMT特征相關(guān)以前尚未研究過，因此作者研究了與免疫細(xì)胞溶解活性（CYT）相關(guān)的潛在生物過程，該過程被用來評估免疫逃逸，使用GZMA和PRF1表達(dá)值的幾何平均值。通過將每種癌癥類型的腫瘤分為CYT high組和CYT low組，GSEA的結(jié)果顯示，免疫相關(guān)途徑和EMT過程在CYT high腫瘤中明顯富集（圖1B和補(bǔ)充圖1B）。CYT high腫瘤傾向于表現(xiàn)出間質(zhì)樣表型，具有較高的EMT特征（補(bǔ)充圖1C）。此外，觀察到在17種類型的癌癥中，間質(zhì)標(biāo)記基因始終與CYT呈正相關(guān)，而上皮標(biāo)記基因通常與CYT呈負(fù)相關(guān)（圖1C）。
????????作者系統(tǒng)地描述了17種不同癌癥類型中免疫浸潤的細(xì)胞組成與EMT特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)免疫細(xì)胞亞群的浸潤與EMT評分呈正相關(guān)（圖1D）。然后，組裝了28個免疫細(xì)胞亞群和83個EMT相關(guān)生長因子的327個轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)與癌細(xì)胞系相比，效應(yīng)細(xì)胞亞群表達(dá)的生長因子與免疫抑制細(xì)胞相似（圖1E）。在83個EMT相關(guān)生長因子中，觀察到55個生長因子不僅在免疫細(xì)胞中顯示出明顯高于癌細(xì)胞系的表達(dá)，而且還顯示出與EMT、CYT和TILs部分的強(qiáng)烈相關(guān)性（補(bǔ)充圖1D）。例如，四種眾所周知的誘導(dǎo)EMT的生長因子（TGFB1、HGF、BMP1和PDGFB），與其他免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞相比，在CD4/8+T細(xì)胞中表現(xiàn)出更高的表達(dá)水平（圖1F和補(bǔ)充圖1D），表明抗免疫逃逸也會通過產(chǎn)生誘導(dǎo)EMT的生長因子促進(jìn)EMT。上述結(jié)果共同證明了免疫逃逸和EMT之間存在著泛癌相關(guān)性，并表明免疫效應(yīng)細(xì)胞可能能夠誘導(dǎo)EMT達(dá)到與免疫抑制細(xì)胞相似的程度。
02 - EMT和免疫逃逸之間的免疫調(diào)節(jié)串?dāng)_決定了癌癥的預(yù)后
????????浸潤免疫效應(yīng)細(xì)胞一般與生存率的提高和對免疫療法的反應(yīng)有關(guān)，而EMT一般與不良后果和免疫抑制有關(guān)。以UCEC為例，CYT評分較高的腫瘤與較長的生存期有關(guān)，而EMT與較差的生存期有關(guān)（圖2A），盡管在UCEC中CYT和EMT是相互正相關(guān)的。作者還在泛癌癥水平上用薈萃分析法檢驗(yàn)了上述觀察結(jié)果，以充分利用不同的癌癥類型，發(fā)現(xiàn)CYT分?jǐn)?shù)與有利的結(jié)果明顯相關(guān)，而EMT則與較差的生存率明顯相關(guān)，盡管這兩個因素之間存在正相關(guān)性。
????????觀察兩個與癌癥結(jié)果呈負(fù)相關(guān)的正相關(guān)因素的困境表明，EMT和免疫逃逸之間的串?dāng)_可能比單獨(dú)的免疫逃逸或EMT更具臨床相關(guān)性。因此作者提出了一個ECI特征，對腫瘤微環(huán)境（TME）中免疫逃逸和EMT之間的串?dāng)_進(jìn)行定量建模，根據(jù)腫瘤中相應(yīng)的CYT評分來估計(jì)EMT偏離預(yù)期量的程度。使用多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型對癌癥類型進(jìn)行校正的泛癌癥分析顯示了顯著的拮抗作用，表明較高的ECI將減少免疫逃逸和生存之間的有益聯(lián)系。對于黑色素瘤，較高的CYT評分只與ECI低的腫瘤的生存獲益明顯相關(guān)（圖2B）。此外，在評估的大多數(shù)癌癥類型中，與單獨(dú)的EMT或CYT相比，ECI是預(yù)測較差生存結(jié)果的更準(zhǔn)確的預(yù)后因素（圖2C）。這些結(jié)果表明，免疫細(xì)胞的高度浸潤并不一定表明有整體的殺傷力。
03 - EMT和免疫逃逸之間的免疫調(diào)節(jié)串聯(lián)與免疫檢查點(diǎn)阻斷的反應(yīng)有關(guān)
????????接下來，作者研究了EMT-免疫軸是否影響了臨床免疫治療反應(yīng)。在五個已發(fā)表的免疫治療數(shù)據(jù)集中，對ICB耐藥的腫瘤與ECI的增加有關(guān)，這些數(shù)據(jù)集都是用ICB療法治療的（圖3A）?？偟膩碚f，在所有的免疫治療數(shù)據(jù)集中，ECI低的腫瘤的反應(yīng)率為60.3%，而ECI高的腫瘤的反應(yīng)率只有36.1%。作者進(jìn)一步確定ECI在預(yù)測ICB反應(yīng)方面的表現(xiàn)。在不同的免疫治療數(shù)據(jù)集中，與TMB、EMT特征或CYT相比，ECI對ICB反應(yīng)的預(yù)測性能始終較好，曲線下面積為0.615-0.758（圖3B）。TMB在不同的數(shù)據(jù)集中表現(xiàn)出適度的預(yù)測性能，而CYT和EMT在其他研究的數(shù)據(jù)集中不具備良好的預(yù)測性能。對此可能的解釋是，ECI被作為EMT和CYT之間串聯(lián)的衡量標(biāo)準(zhǔn)來評估免疫抵抗力，因此總體上具有更好的性能。作者進(jìn)一步比較了EMT、CYT和ECI在ICB反應(yīng)高的癌癥中的分布，包括CESC、BLCA、HNSC、LUSC和LUAD，反應(yīng)相對低的包括OV、PRAD和BRCA。對于CESC、BLCA、HNSC、LUSC和LUAD，CYT相對高于其EMT，而對于OV、PRAD和BRCA，CYT相對低于其EMT。使用ECI，發(fā)現(xiàn)CESC、BLCA、HNSC、LUSC和LUAD的ECI值比OV、PRAD和BRCA低。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了ECI對于識別將從免疫治療中受益的患者的潛在臨床意義。
04 - 免疫浸潤的細(xì)胞組成有助于EMT和免疫逃逸之間的串?dāng)_
????????上圖顯示，幾乎所有免疫細(xì)胞都產(chǎn)生一組相似的生長因子，并與EMT特征呈正相關(guān)。然而，免疫逃逸是由免疫效應(yīng)細(xì)胞和抑制細(xì)胞的相對組成決定的。作者假設(shè)，確定免疫浸潤的細(xì)胞組成對于理解免疫逃逸和EMT之間的串?dāng)_至關(guān)重要。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，使用皮爾遜相關(guān)分析法對每種癌癥類型的ECI與不同免疫細(xì)胞類型的相對部分之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞、激活記憶CD4+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）、漿細(xì)胞、T輔助細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞和激活NK細(xì)胞的浸潤與ECI呈明顯的負(fù)相關(guān)。而M0/M2巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、幼稚CD4+T細(xì)胞和靜息記憶CD4+T細(xì)胞在泛癌癥水平上與ECI呈顯著正相關(guān)（圖4A）。這些結(jié)果與抗免疫逃逸的對立作用相一致。作為一個案例研究，進(jìn)行免疫組化檢測，標(biāo)記巨噬細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞，檢測肺癌中波形蛋白的表達(dá)。M1同時(shí)表達(dá)CD68和CD16，M2同時(shí)表達(dá)CD68和CD163，代表性的圖像顯示在圖4B中。通過評估免疫組化結(jié)果，分析了波形蛋白表達(dá)與M1、M2或CD8+T細(xì)胞浸潤之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，波形蛋白的表達(dá)與肺癌中的M1和M2數(shù)量呈正相關(guān)，但與M1/M2的比例呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)，波形蛋白的表達(dá)與肺癌中CD8+T細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)（圖4C）。
????????然而，免疫浸潤和ECI之間的相關(guān)性也顯示了不同類型癌癥之間的異質(zhì)性（圖4D）。在大多數(shù)癌癥類型中，較高比例的浸潤免疫細(xì)胞與ECI呈正相關(guān)，而只有兩種類型的癌癥（CESC和UCEC）有較高比例的浸潤免疫細(xì)胞與ECI呈負(fù)相關(guān)。
????????作者還研究了OV和HNSC，其中的間質(zhì)亞型已被確定，并觀察到在癌癥的間質(zhì)亞型中始終擁有相對較高的M2巨噬細(xì)胞比例，而CD8+T細(xì)胞和T輔助細(xì)胞的比例相對較低（圖4D）。為了獲得免疫組成如何決定ECI的總體視圖，作者根據(jù)22種免疫亞群的相對比例，用UMAP對泛癌腫瘤樣本進(jìn)行聚類（圖4E）。對免疫浸潤的細(xì)胞組成的聚類分析顯示了從ECI低的腫瘤到ECI高的腫瘤的明顯過渡，這表明ECI是由免疫浸潤的細(xì)胞組成決定的。這與觀察到的對ICB的反應(yīng)與ECI有關(guān)是一致的。進(jìn)一步將免疫細(xì)胞分為有利于免疫的組和有利于EMT的組，它們可能分別向抗免疫逃逸或EMT傾斜。對免疫浸潤的細(xì)胞組成進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)不同類型的癌癥之間有利于免疫和有利于EMT的細(xì)胞分布具有異質(zhì)性（圖4F）。本研究中評估的大多數(shù)類型的癌癥在TME中都顯示出有大量的有利于EMT的細(xì)胞浸潤，而只有兩種類型的癌癥（CESC和UCEC）有大量有利于免疫的細(xì)胞浸潤。
05 - 影響EMT和免疫規(guī)避之間的免疫調(diào)節(jié)串聯(lián)的分子和遺傳特征的描述
????????接下來，作者研究了腫瘤細(xì)胞的分子和遺傳特征是否會影響EMT和抗免疫逃逸之間的免疫調(diào)節(jié)串?dāng)_。據(jù)報(bào)道，基因的非同義突變有助于腫瘤細(xì)胞中新抗原的產(chǎn)生，因此可能增加效應(yīng)免疫細(xì)胞的浸潤。作者首先研究了CYT-EMT串?dāng)_與基因組特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在不同類型的癌癥中，非同義突變的總體速率與CYT水平呈正相關(guān)（補(bǔ)充圖4A），免疫細(xì)胞如CD8T細(xì)胞與ECT負(fù)相關(guān)（補(bǔ)充圖4B）。相反，非同義突變的總量與EMT特征（補(bǔ)充圖4C）和與ECT正相關(guān)的免疫細(xì)胞部分如M2巨噬細(xì)胞（補(bǔ)充圖4D）都呈負(fù)相關(guān)。與上述結(jié)果一致，作者發(fā)現(xiàn)在多種類型的癌癥中，ECI與整體非同義突變負(fù)擔(dān)呈負(fù)相關(guān)（圖5A），突變負(fù)荷與免疫細(xì)胞的浸潤有關(guān)，與 ECT 呈負(fù)相關(guān)。
????????有報(bào)道稱，基因組不穩(wěn)定性與癌癥免疫有關(guān)。作者研究了基因組不穩(wěn)定性與EMT和免疫逃逸之間的相互作用的關(guān)聯(lián)。在多種類型的癌癥中，染色體不穩(wěn)定性與ECI之間存在明顯的正相關(guān)，這表明染色體不穩(wěn)定性與免疫細(xì)胞的浸潤正相關(guān)ECI（圖5B）。由于抗免疫逃逸可能選擇具有遺傳特征的腫瘤，使其對免疫攻擊具有抵抗力，從而富集了與免疫細(xì)胞正相關(guān)的ECI，作者進(jìn)一步調(diào)查了參與抗原呈遞的基因的突變。在幾種類型的癌癥中，HLA-A/B/C基因的突變與較高的CYT水平有關(guān)，但并不總是與明顯較高的EMT特征有關(guān)（圖5C）。HLA基因的突變與CD8+效應(yīng)T細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)，但與Tregs沒有關(guān)聯(lián)（補(bǔ)充圖4E）。這些結(jié)果表明，HLA基因的突變并不增加EMT，盡管它們可能有利于逃避免疫攻擊。
06 - 致癌基因改變與EMT和免疫逃逸之間的免疫調(diào)節(jié)性串?dāng)_有關(guān)
????????腫瘤驅(qū)動基因在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。因此，作者推斷致癌基因的改變可能是EMT和免疫逃逸之間的平衡的原因。作者重點(diǎn)研究了以前的泛癌癥研究中發(fā)現(xiàn)的373個有突變的驅(qū)動基因和200個有CNV的驅(qū)動基因。進(jìn)行了了泛癌癥回歸分析，調(diào)整了背景突變率和腫瘤類型，發(fā)現(xiàn)23個突變的、18個擴(kuò)增的和20個刪除的驅(qū)動基因與ECI明顯相關(guān)。在這些改變的驅(qū)動基因中，CASP8是與CESC和HNSC的ECI相關(guān)的最豐富的基因（圖5D）。
????????發(fā)現(xiàn)TP53信號通路的基因（如MDM2、TP53和CDKN2A）含有與ECI明顯相關(guān)的驅(qū)動改變。作者觀察到P53的突變與ECI呈正相關(guān)（圖5D）?？傊@些確定的與ECI相關(guān)的致癌基因改變可能作為EMT和免疫逃避之間的免疫調(diào)節(jié)串?dāng)_的基因組驅(qū)動因素。
四、結(jié)論
????????總之，本研究采用了大規(guī)模的定量多組學(xué)方法來描述廣泛的實(shí)體瘤中EMT和免疫逃逸之間復(fù)雜而動態(tài)的免疫調(diào)節(jié)串?dāng)_。確定了與EMT和免疫逃逸之間的平衡有關(guān)的潛在因素。這里介紹的所有這些結(jié)果和模型加深了對腫瘤和免疫與EMT相互作用的復(fù)雜性的理解，并可能有助于為預(yù)測免疫療法反應(yīng)的新型生物標(biāo)志物的開發(fā)提供更好的機(jī)制洞察力。
