Bisulfitesequencing，實(shí)驗(yàn) BS 處理 C->U(T) 轉(zhuǎn)化效率并不是 100% 的，轉(zhuǎn)化失敗的部分 C 會(huì)成為假陽(yáng)性信號(hào)，所以 BS 轉(zhuǎn)化率也是很重要的指標(biāo)。計(jì)算轉(zhuǎn)化率需要建庫(kù)實(shí)驗(yàn)摻入已知不含甲基化的 DNA（由于線粒體 DNA 可以認(rèn)為是無甲基化修飾的 DNA，也可使用線粒體 DNA 來評(píng)估），理論上所有該 DNA 的C 都會(huì)被轉(zhuǎn)化為 U(T)，通過比對(duì)和甲基化計(jì)算分析，會(huì)得到該 DNA 的甲基化率為 0. 實(shí)際肯定不為 0，這部分甲基化就是轉(zhuǎn)化失敗的，所以 1 減去甲基化率就是轉(zhuǎn)化率。BS 轉(zhuǎn)化率，我們一般要求要在 99%以上。摻入已知不含甲基化的 DNA 一般常用是 Enterobacteria phage lambda (lambda DNA)。參考基因組序列 NC_001416.1 可以在 NCBI 下載：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_001416.1如果使用樣本本身的線粒體 DNA 來評(píng)估，建議使用線粒體 DNA 上非 CG 位點(diǎn)/或者 CC 位點(diǎn)的甲基化水平來評(píng)估。

1.比對(duì)

bsmap -a 1.fq -b 2.fq -d lambda.fa/chrMt.fa -o BSconvert.sam -p 8 -z 33 -r 1 -m 50 -x 1000

2.sam2bam

samtools view -Sb BSconvert.sam > BSconvert.bam

3.提取甲基化位點(diǎn)

python methratio.py -d lambda.fa/chrMt.fa -m 1 -o BSconvert.met.txt BSconvert.bam

4.統(tǒng)計(jì)甲基化轉(zhuǎn)化率

perl -alne 'next if $.==1; next if $F[3] eq "CG"; $m+=$F[6]; $n+=$F[7]; END{ print "“BS_convert_ratio\t".sprintf("%.5f", $n/($m+$n));}' BSconvert.met.txt