關于測序原理稍微了解過一點點
所以就復習了一下自己以前的筆記
圖片來源不詳，都是網(wǎng)上找的，僅供本人自己學習使用
講解測序原理：http://www.itdecent.cn/p/101c14c3a1d2（后面數(shù)據(jù)處理那塊沒看懂，以后再看）
Sanger測序的原理：在體系中混入一定量帶有熒光標記的ddNTP，它們結合上去后會終止后續(xù)dNTP繼續(xù)連接上去，從而形成不同長度的片段，先經(jīng)過電泳將不同長度的條帶分離，再根據(jù)不同的熒光信號區(qū)分那個位置的堿基是哪一個。
第一代測序技術的主要特點就是測序讀長可達1000bp，準確性高達****99.999%，二三代所不能及），而是因為它的通量低，成本高。
Illumina測序原理
主要有4個步驟：sample preparation，cluster generation，sequencing，data analysis
每一輪只延長一個堿基，測完以后再延長下一個堿基，一個一個測。
通過加接頭的方式，可以一次測出多個不同序列（高通量）
加入特殊的dNTP【它的3‘ 羥基被疊氮基團替代，因此每次只能添加一個dNTP；還含有熒光基團，能激發(fā)不同顏色】；
在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫掉；
再加入激發(fā)熒光緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號，光學設備記錄熒光信號的記錄，計算機將光學信號轉化為測序堿基
再加入化學試劑淬滅熒光信號并使dNTP 3’ 疊氮基團變成羥基，這樣能繼續(xù)向下進行再加一個，并且保證這個不再發(fā)出熒光。如此重復直至所有鏈的堿基序列被檢測出。
兩端加接頭實現(xiàn)高通量：P5和P7是用來使片段固定在lane上的，這樣經(jīng)過約35輪PCR，附近的區(qū)域都是相同的序列，形成一個cluster，使信號放大。
為什么能測序的長度有限？
因為錯誤會不斷積累。等到了后面錯誤多的時候系統(tǒng)無法判斷誰是真實的信號誰是干擾信號，就會在結果中給出N
PhiX Control v3 Library 是來自于噬菌體的一個庫，ATCG比例較為均衡，常用于平衡illumina各通道熒光信號。
有些文庫的信號比較平衡，這時沒啥問題。
但是有些庫的信號不太平衡，特別是在前幾個循環(huán)，如果信號都集中于某一個堿基，機器可能難以把各個cluster區(qū)分開。所以要加入一定比例的PhiX作為control
三代測序-單分子測序-有很多不同的技術，利用熒光或電流檢測不同的堿基。主要思想是不經(jīng)過PCR直接對單個DNA分子測序，有SMRT技術和納米孔技術等。
讀長可以很長，錯誤率可以達到15%，要通過重復測來糾錯。
