引言
此前我們介紹了蛋白質相互作用篩選實驗中常用的IP-MS、PL-MS、Pull down等3種技術的選擇策略，以及PL-MS實驗中3種標記酶、穩(wěn)轉/瞬轉等常見選擇的區(qū)別，本文我們以CRISPR/Cas9基因編輯技術、TurboID鄰近標記方案為例，為研究生提供一套詳細、可操作的實驗流程。方案將涵蓋從POI-TurboID融合表達系統(tǒng)的設計與構建，到穩(wěn)轉細胞系的建立與驗證，再到鄰近生物素化標記、細胞裂解、鏈霉親和素富集以及樣品制備用于質譜分析的全過程。
通過遵循本方案，研究者有望高效、準確地鑒定其POI在生理條件下的互作蛋白，為深入理解其生物學功能和相關疾病機制提供關鍵線索。本方案基于編者文獻查詢及經驗總結，不同課題的POI、細胞等條件不一，本文僅提供實驗通用條件起步參考，實際課題應根據實驗反饋做方法學優(yōu)化調整。
TurboID融合表達系統(tǒng)的構建
成功進行TurboID鄰近標記實驗的前提是構建一個能夠穩(wěn)定、適度表達POI-TurboID融合蛋白的細胞模型。
選擇合適的TurboID融合策略
在設計POI-TurboID融合蛋白時，需要仔細考慮以下兩點：
?融合位置 (N端 vs. C端):將TurboID融合到POI的N端還是C端，取決于POI本身的特性。應綜合評估POI已知的N端或C端結構域、功能區(qū) (如酶活性中心、結合位點)、定位信號 (如核定位信號NLS、線粒體導肽MTS) 以及可能的空間位阻效應。理想情況下，融合不應干擾POI的正確折疊、亞細胞定位和生物學功能。查閱相關文獻中POI的已知信息或進行小規(guī)模預實驗探索是明智的選擇。
?Linker序列:在POI和TurboID之間插入一段柔性Linker序列，如(GGGGS)n (n通常為1-3)，有助于減少兩者之間的空間位阻，促進各自結構域的正確折疊，并可能提高融合蛋白的穩(wěn)定性和功能性。
策略一：CRISPR/Cas9介導的內源性POI-TurboID融合
?(強烈推薦)
核心優(yōu)勢: 此策略將TurboID編碼序列精確整合到細胞基因組中POI的內源性基因座，使得POI-TurboID融合蛋白在內源性啟動子和調控元件的控制下表達。這種方式能夠維持生理相關的表達水平，避免了過表達可能導致的蛋白質錯誤定位、聚集、細胞毒性以及非特異性相互作用的增加，從而更真實地反映POI在細胞內的天然互作網絡 (U?kun et al., Bio-protocol 2022)。
01.sgRNA (single guide RNA) 設計與驗證
●設計原則：
?N端融合: 選擇緊鄰POI基因翻譯起始密碼子 (ATG) 之后，編碼區(qū)內的切割位點。
?C端融合:選擇緊鄰POI基因翻譯終止密碼子 (e.g., TAA, TAG, TGA) 之前的切割位點。
?確保切割位點盡可能靠近期望的TurboID插入位點，以提高同源重組修復 (Homology Directed Repair, HDR) 的效率。
●設計工具：利用常用的在線sgRNA設計工具，如Broad Institute GPP sgRNA Designer, Benchling, CRISPOR等。這些工具通常會提供sgRNA序列、預測的切割效率 (on-target score) 和潛在的脫靶位點 (off-target score)。選擇高on-target、低off-target的sgRNA。
●sgRNA驗證(可選但推薦):?在正式實驗前，可通過體外切割實驗 (用純化的Cas9蛋白和體外轉錄的sgRNA切割PCR產物) 或在細胞內進行T7核酸內切酶I (T7E1) / Surveyor酶切分析等方法，驗證篩選出的sgRNA的實際切割效率。
02.同源重組修復模板 (HDR Donor) 設計與構建
HDR Donor質粒是提供TurboID序列以及用于篩選的元件，并通過同源臂介導其精確插入到Cas9切割位點的模板。
●關鍵元件：
?TurboID編碼序列: 確保其讀碼框與POI基因正確連接，避免產生移碼突變。
?親和標簽 (可選):如3xFLAG、HA、V5等，通常融合在TurboID的N端或C端 (不與POI直接接觸的一端)，便于后續(xù)通過Western Blot檢測融合蛋白的表達和分子量，以及通過免疫熒光進行亞細胞定位。
?篩選標記 (可選但常用):如Puromycin (PuroR)、Neomycin (NeoR) 或Hygromycin B (HygroR) 抗性基因。這些抗性基因通常需要自帶獨立的啟動子 (如PGK或EF1α) 和polyA信號，以便在成功整合后表達，用于篩選陽性細胞克隆。有時也會使用2A自剪切肽序列 (如P2A, T2A) 將抗性基因與TurboID連接，使其在同一轉錄本上表達但翻譯后分離。
??同源臂 (Homology Arms): 位于TurboID (及標簽、抗性基因) 序列的兩側，分別與POI基因切割位點上游和下游的基因組序列完全同源。同源臂的長度對HDR效率至關重要，通常單側長度為500 bp - 1 kb，甚至更長。
●構建方法：通過PCR從已有模板中擴增上述各元件 (POI的上下游同源臂、TurboID序列、標簽、抗性基因盒等)，然后利用無縫克隆技術如Gibson Assembly、Golden Gate Assembly或傳統(tǒng)的限制性內切酶連接方法，將這些片段組裝成完整的HDR Donor質粒。構建完成后，務必通過Sanger測序驗證Donor質粒序列的準確性，特別是同源臂和連接區(qū)域。 (Cho et al., Nat Protoc 2020 提及了融合構建的設計原則)。
03.Cas9核酸酶表達
Cas9核酸酶負責在sgRNA的引導下切割基因組DNA。
●質粒共轉染:將表達Cas9的質粒 (如pX330, lentiCRISPR v2等，后者同時表達sgRNA和Cas9) 與sgRNA表達質粒 (若分開) 和HDR Donor質粒一同轉染到靶細胞中。
●核糖核蛋白復合物 (RNP) 轉染:將體外純化的Cas9蛋白與合成或體外轉錄的sgRNA預先孵育形成RNP復合物，然后與HDR Donor質粒一同導入細胞。RNP的優(yōu)勢在于作用時間短暫，可降低脫靶效應。
●穩(wěn)定表達Cas9的細胞系:如果實驗室有穩(wěn)定表達Cas9的細胞系，則只需轉染sgRNA表達質粒和HDR Donor質粒。
策略二：基于質粒的POI-TurboID過表達系統(tǒng)構建
適用場景: 當CRISPR/Cas9基因編輯在特定細胞系中效率低下、實驗周期要求較短以進行快速初步探索、或某些研究確實需要較高表達水平時，可以考慮構建基于質粒的過表達系統(tǒng)。
01.表達載體選擇
●骨架:選擇帶有強效組成型啟動子 (如CMV, EF1α) 或誘導型啟動子 (如Tet-On/Off系統(tǒng)，可調控表達水平) 的哺乳動物細胞表達載體。
●關鍵元件:
多克隆位點 (MCS):用于插入POI的編碼序列 (CDS)。
預置的TurboID編碼序列:許多商業(yè)化或Addgene共享的載體已包含TurboID序列，并提供N端或C端融合的選項。
親和標簽:如3xFLAG, V5, Myc等，通常已整合在TurboID序列旁或MCS中。
篩選標記:如Neomycin (G418抗性), Puromycin, Hygromycin B等，用于篩選穩(wěn)定轉染的細胞。
●示例載體:pCMV-TurboID-3×FLAG-Neo 是一個典型的哺乳動物表達載體，包含CMV強啟動子驅動POI-TurboID-3xFLAG融合蛋白的表達，并帶有Neomycin抗性基因用于篩選穩(wěn)轉細胞系 (來源: Novopro.cn)。
02.POI-TurboID融合基因的克隆
●POI基因獲取:通過PCR從cDNA文庫、已有的質?；蚍崔D錄的總RNA中擴增POI的完整編碼區(qū) (CDS)。設計引物時需考慮去除原有的終止密碼子 (若進行C端融合) 或起始密碼子 (若進行N端融合，且載體已提供起始密碼子)。
●克隆方法:
傳統(tǒng)酶切連接:利用載體MCS中合適的限制性內切酶位點和POI擴增產物兩端引入的相應酶切位點進行酶切和連接。
無縫克隆技術:如Gibson Assembly, In-Fusion Cloning, 或Golden Gate Assembly。這些方法不依賴特定的酶切位點，通過短同源臂介導DNA片段的定向組裝，操作更靈活高效。Golden Gate Assembly因其模塊化和高通量的特點，在構建復雜質粒時尤其受歡迎 (Cell Reports Methods S2667-2375(24)00183-8; STAR Protocols)。
●序列驗證:質粒構建完成后，務必通過Sanger測序驗證POI與TurboID的連接是否正確，讀碼框是否無誤，以及POI序列本身有無突變。
小結
本文我學習了TurboID融合表達系統(tǒng)的構建，其中包括基于CRISPR/Cas9技術的內源性POI-TurboID融合表達，和基于質粒的POI-TurboID過表達系統(tǒng)構建，希望對你們也有幫助。由于完整的PL-MS實驗指南篇幅過長，我打算分多篇文章發(fā)布，接下來我將學習穩(wěn)轉細胞系的建立，包括質粒的轉染和單克隆的挑選以及細胞系的驗證。另外TurboID鄰近標記和親和富集實驗的具體實驗步驟以及實驗難點和常見解決辦法我也將在接下來幾篇內容中整理，歡迎持續(xù)關注！
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