最近我們連續(xù)解讀了3篇P53在CRISPR-Cas9基因編輯過程中的影響，目前第4篇還在撰寫中。為了調(diào)劑一下文獻(xiàn)閱讀的凝重感，今天咱們更點(diǎn)短小精悍的。在我們之前的推文中提到過，桑格測(cè)序是CRISPR-Cas9基因編輯結(jié)果的金標(biāo)準(zhǔn)。一般我們先將多個(gè)單克隆細(xì)胞的PCR產(chǎn)物送測(cè)序，選擇擁有套峰的單克隆細(xì)胞進(jìn)行T載體連接測(cè)序，用以檢驗(yàn)最終的基因型。關(guān)于如何解讀桑格測(cè)序封圖，可以參考測(cè)序公司給的文檔，感興趣也可以點(diǎn)擊我們之前的文章：看不懂測(cè)序峰圖就好像有答案都不會(huì)抄
如何判斷CRISPR編輯成功，怎么拆套峰?
該怎么送樣本，送什么樣本進(jìn)行sanger測(cè)序？什么樣的sanger測(cè)序結(jié)果才是基因編輯成功的樣子？這是一個(gè)比較高頻率的問題。同時(shí)我們?cè)诜鍒D解析的文章中提到過手動(dòng)拆套峰，因此如何拆套峰，也常被問到。
1. 該送什么樣本
在獲取單細(xì)胞克隆并將將細(xì)胞擴(kuò)增后，一般我們會(huì)按照以下順序準(zhǔn)備兩種樣本：
（1）提取上述細(xì)胞的基因組DNA，由高保真DNA聚合酶擴(kuò)增的，含有g(shù)RNA ontarget位點(diǎn)的DNA片段。強(qiáng)調(diào)一定要是高保真酶P出來的序列，我們通過觀察PCR產(chǎn)物峰圖來挑選進(jìn)一步驗(yàn)證的單細(xì)胞克隆。
（2）將該DNA片段通過解鏈，與T載體連接并轉(zhuǎn)化后，挑取的單菌落搖起來的菌液。
加送PCR所用的引物，選擇單邊用于sanger測(cè)序，原因：
（1）省錢：無需公司額外合成引物；
（2）不用公司通用引物：因?yàn)樽赃B的T載體在通用引物下也能被測(cè)出來，只要測(cè)出來就收費(fèi)。使用PCR所用的引物，可以精準(zhǔn)跟蹤目的基因的基因型變化，既省錢又免去在查閱自連載體測(cè)序結(jié)果上的時(shí)間。
2. CRISPR-Cas9基因編輯結(jié)果可能出現(xiàn)的峰圖
我們以依賴NHEJ修復(fù)的CRISPR-Cas9基因敲除為例，可能出現(xiàn)的峰圖如下圖：
依據(jù)PCR產(chǎn)物峰圖結(jié)果，我目前的工作流程如下：
3. 為什么要手動(dòng)拆峰？
我們需要最終的基因型sanger測(cè)序結(jié)果，用于文章發(fā)表。在一切順利的情況下，其實(shí)不花多少時(shí)間。但如果T載體連接失敗或者總是只測(cè)到單邊序列，急于知道基因編輯結(jié)果時(shí)，可以選擇手動(dòng)拆峰。
我目前的手動(dòng)拆峰方法是來自于DZ師兄的言傳身教，如果大家有什么新的方法，可以在評(píng)論中指出，感謝~我們的手動(dòng)拆峰方法要求一定要有以下兩個(gè)結(jié)果：
（1）PCR sanger測(cè)序結(jié)果：通過實(shí)驗(yàn)獲得
（2）其中一條鏈的序列：通過實(shí)驗(yàn)獲得，或者通過工具獲得。
4. Poly Peak Parser：拆峰工具
如果已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得了其中一條鏈的序列，我們可以直接手動(dòng)拆峰。當(dāng)T載連接實(shí)驗(yàn)總是失敗時(shí)，我們也可以依據(jù)PCR產(chǎn)物sanger測(cè)序峰圖，使用網(wǎng)頁Poly Peak Parser推導(dǎo)其中一條鏈的序列。該網(wǎng)頁工具的界面和使用方法都非常簡(jiǎn)單，在推薦給大家之前，我使用自己的測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證過，目前沒發(fā)現(xiàn)有錯(cuò)的結(jié)果，可以十分精準(zhǔn)的推測(cè)出二倍體細(xì)胞在基因編輯后的其中一條鏈的序列。
5. 手動(dòng)拆峰
工作思路如下：
（1）PCR序列：讀取PCR測(cè)序結(jié)果的上峰圖為PCR序列1，將套峰下峰的序列讀出為PCR序列2
（2）T vector測(cè)到的/軟件分析出的其中一條鏈的序列，我們先稱之為T序列：摘取T序列和PCR序列1,2進(jìn)行比對(duì)，摘取的位置從gRNA位點(diǎn)前（雙峰出現(xiàn)前5-10個(gè)堿基）開始，一直到T序列突變位置結(jié)束后5-10個(gè)序列。通過同位點(diǎn)的上下替換，使得其中一條PCR序列和T序列一致，則剩下的PCR序列則為另外一條鏈的序列結(jié)果。
用文字描述非常難以理解，我們用過實(shí)際樣本進(jìn)行進(jìn)行推測(cè)吧。
將PCR上峰和下峰序列讀出
我們?cè)陔p峰出現(xiàn)位點(diǎn)前幾個(gè)堿基開始讀取序列（圖中藍(lán)色選取部分）如下：
將T載體序列和PCR上峰，PCR下峰序列抄下來比對(duì)。通過同位點(diǎn)堿基替換使得PCR下峰序列和T在序列一致，經(jīng)替換后的PCR上峰序列，則為另外一條鏈的結(jié)果。將該序列保存為DNA序列，加入到軟件中比對(duì)可看到，另外一條鏈的基因編輯結(jié)果為一個(gè)A堿基的插入。結(jié)合兩條鏈的結(jié)果，都沒有出現(xiàn)3的倍數(shù)的堿基缺失或插入，初步認(rèn)定該細(xì)胞為成功的敲除細(xì)胞系。
以上拆峰適用于二倍體的單細(xì)胞克隆細(xì)胞系。如果發(fā)現(xiàn)拆峰結(jié)果不匹配或者拆峰無法順利進(jìn)行（上下沒有可替換的堿基），則說明該細(xì)胞可能為多倍體或者多克隆細(xì)胞系。
小結(jié)
拆峰是個(gè)手藝活，需要用眼睛慢慢看，過程可能枯燥乏味，但對(duì)trouble shooting很有幫助。同時(shí)對(duì)急于需要知道細(xì)胞基因型，才能進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)，有這么一手還是很舒心滴！最后，歡迎小伙伴們提出自己寶貴的經(jīng)驗(yàn)，幫助我進(jìn)一步學(xué)習(xí)，感謝~
部分前期文章：
- 我們用兩篇文章的篇幅大概講了一遍質(zhì)粒骨架及其各個(gè)要素的介紹：
解剖式學(xué)習(xí)一個(gè)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)--update
質(zhì)粒系列之什么是質(zhì)粒 - 再談了最傳統(tǒng)的限制性克隆：
質(zhì)粒系列之限制性克隆--restriction cloning - 前面還夾雜的講過一些piggybac、gateway、RMCE的一些內(nèi)容：
基因編輯如何換藥不換湯 -
慢病毒系列也有講過兩篇：
團(tuán)隊(duì)作案HEK293，史上最強(qiáng)搬磚細(xì)胞
不想再用慢病毒了，我還有什么別的選擇嗎？piggyBac transposon - 此外我們本還有一個(gè)CRISPR screening的專題，只有開頭，未得完善：精準(zhǔn)大海撈針--5. CRISPR screening專題
- 質(zhì)粒系列之再談無縫連接--Gibson assembly
- Golden Gate，質(zhì)粒改造的王者
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- CRISPR和TP53文獻(xiàn)解讀之：Cas9誘導(dǎo)P53激活并導(dǎo)致細(xì)胞死亡
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- 怎么肥事：P53你竟然不讓我HDR精準(zhǔn)修復(fù)！
