大家好，本周給大家分享的是一篇2020年6月2日發(fā)表在Cell Host and Microbe上使用比較基因組學(xué)解析毛螺菌科分離株之間的功能和基因組變異并揭示其種間和種內(nèi)的物種多樣性的文章。
文章題目： Functional and Genomic Variation between Human-Derived Isolates of Lachnospiraceae Reveals Inter- and Intra-Species Diversity (人源毛螺菌科分離株之間的功能和基因組變異揭示了種間和種內(nèi)的物種多樣性)
期刊： Cell Host and Microbe
影響因子： 2020_IF = 15.923 ; 中科大類: 生物 1區(qū); 中科小類: 微生物學(xué) 1區(qū), 寄生蟲(chóng)學(xué) 1區(qū), 病毒學(xué) 1區(qū); JCR分區(qū): Q1
發(fā)文單位：芝加哥大學(xué)
文章作者：Matthew T.Sorbara為第一作者，Eric G.Pamer為通訊作者。
摘要：在健康人體內(nèi)，屬于毛螺菌科的細(xì)菌是微生物群中數(shù)量豐富的專性厭氧成員。毛螺菌科通過(guò)產(chǎn)生短鏈脂肪酸，將初級(jí)膽汁酸轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽汁酸，并促進(jìn)對(duì)腸道病原體的定植抗性，從而影響宿主。 為了加深對(duì)該科成員基因組和功能多樣性的了解，本文作者從人類糞便中培養(yǎng)了來(lái)自Lachnospiraceae 11屬27種的273株分離株，并進(jìn)行了全基因組測(cè)序和基因注釋。 該分析揭示了可能影響分離株影響宿主健康能力的途徑中物種間和物種內(nèi)的大量多樣性。 這些差異可能通過(guò)抗生素表達(dá)或腸道酸化影響定殖抗性，通過(guò)丁酸鹽的產(chǎn)生影響宿主粘膜免疫細(xì)胞和腸細(xì)胞，或通過(guò)異質(zhì)性多糖代謝促進(jìn)聯(lián)合治療內(nèi)的協(xié)同作用。 這些特定功能的識(shí)別可以促進(jìn)益生菌群的發(fā)展，驅(qū)動(dòng)和/或恢復(fù)體內(nèi)微生物組的功能。
主要結(jié)果：
1、毛螺菌科分離株的鑒定
作者對(duì)20個(gè)志愿者的糞便樣本分別進(jìn)行培養(yǎng)和測(cè)序。對(duì)糞便樣本的宏基因組分析表明，毛螺菌科在所有志愿者中都豐富，平均豐度為23.4%（圖1）。通過(guò)培養(yǎng)，獲得了956個(gè)分離株。分離株是采用BLAST技術(shù)對(duì)宏基因組序列組裝而成的16S rRNA基因序列進(jìn)行分類。分離出志愿者中具有代表性的65%屬 (圖1)，以及通過(guò)對(duì)糞便進(jìn)行宏基因組測(cè)序檢測(cè)到的屬于毛螺菌科的所有屬。基于16S rRNA序列分析，共鑒定出27種毛螺菌科273株分離株。
圖1.人類志愿者共生菌株生物庫(kù)的建立。上圖宏基因組測(cè)序確定了人類志愿者糞便樣品中細(xì)菌屬水平的相對(duì)豐度，在下圖中顯示了未恢復(fù)的屬。
2、毛螺菌科的系統(tǒng)發(fā)育
作者在毛螺菌科系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上發(fā)現(xiàn)其分離株與同樣屬于梭菌目的瘤胃菌科或梭菌科的代表株不同，且活潑瘤胃球菌分離株被定位在毛螺菌科內(nèi)（圖2A）。還看了毛螺菌科分離株的全基因組GC含量，得出毛螺菌科的GC含量范圍很廣，并且特定種的分離株具有特征的GC含量，一個(gè)屬內(nèi)的分離株具有相似的GC含量（圖2B）。
圖2.來(lái)自人類志愿者的毛螺菌科分離株的系統(tǒng)發(fā)育研究(A) 基于16SrRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(B) 毛螺菌科分離株基因組的GC含量
3、分離株核心基因組的多樣性
作者通過(guò)prokka進(jìn)行基因注釋，發(fā)現(xiàn)其基因組中只有50%的基因被注釋。且在科水平上只存在397個(gè)核心基因，表明物種間的遺傳多樣性（圖3）。將注釋基因的功能映射到KEGG通路，發(fā)現(xiàn)不同分類水平的分離株之間共享的大多數(shù)基因都與新陳代謝有關(guān)，但不同分類水平的分離菌株所共享的代謝途徑的類型是不同的（圖3）。
圖3。Lachnospiraceae分離株核心基因組的比較確定了分離株之間的多樣性(A)繪制不同分類水平分離株共享的核心基因(注釋蛋白和假定蛋白)數(shù)量。 (B)不同類別的編碼序列的比例，根據(jù)注釋的類型，成為在不同分類水平的分離株的子集共享。 (C)被分配到不同水平KEGG通路的基因的比例，成為在不同分類水平的分離株的子集共享。 (D)按科、屬或種分組的分離株的子集共享到特定KEGG通路的基因百分比。
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毛螺菌科分離株的遺傳圖譜
作者還分析了單個(gè)分離株的遺傳圖譜模式。通過(guò) UMAP對(duì)所有毛螺菌科中是否存在注釋的基因和蛋白質(zhì)簇進(jìn)行分析，結(jié)果表明，分離株根據(jù)其整個(gè)基因組形成了不同的簇。在大多數(shù)情況下，聚集的分離株只包含一個(gè)物種，而在極少數(shù)情況下，不能根據(jù)它們的遺傳圖譜區(qū)分兩個(gè)物種。毛螺菌科是一種可以產(chǎn)生SCFAs的發(fā)酵共生菌，從而有助于近端結(jié)腸和盲腸內(nèi)腔的正常適度酸化。酸化培養(yǎng)基的能力如何分布在毛螺菌科分離株中？在UMAP上，超高酸化與 UMAP 位置相對(duì)應(yīng)，并且沿 UMAP 的兩個(gè)軸的組合變化。SCFA丁酸鹽對(duì)宿主粘膜免疫系統(tǒng)細(xì)胞具有重要的調(diào)節(jié)功能，在接受移植的患者中，編碼丁酸合成途徑的共生物種定殖與抗病毒感染有關(guān)。因此，作者檢測(cè)了毛螺菌科分離株乙酰coa產(chǎn)丁酸鹽的基因分布，在90/273株菌株中鑒定了乙酰coa產(chǎn)生丁酸的完整通路。在UMAP全基因組分析中，與單個(gè)物種相對(duì)應(yīng)的具有乙酰輔酶A生產(chǎn)丁酸完整途徑的分離株出現(xiàn)在不同的簇中。
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圖4.通過(guò)對(duì)單個(gè)分離株遺傳庫(kù)的分析，可以確定相關(guān)分離株的聚類。(A)Lachnospiraceae中存在或不存在獨(dú)特編碼序列(注釋蛋白或未注釋蛋白簇)的UMAP分析圖。 (B) UMAP分析(來(lái)自A)顯示單獨(dú)分離株生長(zhǎng)48小時(shí)后酸化。 (C)在乙酰輔酶a轉(zhuǎn)化為丁酸鹽的途徑中分離出一套完整的基因。
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核心基因組的序列變異性及評(píng)估16S rRNA相關(guān)性作為全基因組遺傳圖譜的象征
作者還看了毛螺菌科核心基因組的基因是否存在序列變異，以及這種變異是否與基于16S rRNA序列的種水平鑒定相一致。對(duì)每個(gè)注釋的科水平的核心基因的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了比對(duì)，并將得到的多個(gè)序列連接成一個(gè)大的蛋白質(zhì)序列(圖5A)。然后，對(duì)連接的大序列進(jìn)行比對(duì)，生成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。該分析表明，來(lái)自相同16S rRNA定義的種的分離株也通過(guò)其核心基因組的序列變異性而相互關(guān)聯(lián)，且分離株之間的總體關(guān)系與16S rRNA衍生的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系一致(圖5)。通過(guò)對(duì)全基因組編碼序列的UMAP分析，來(lái)自相關(guān)類群的分離株(基于16S rRNA)傾向于定位在一起。為了進(jìn)一步研究這一點(diǎn)，作者想看16S rRNA來(lái)源的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)中的分離株之間距離是否與分離株之間的全基因組來(lái)源距離相關(guān)。結(jié)果表明，在37128個(gè)兩兩比較中，16S rRNA衍生距離與全基因組衍生距離呈顯著正相關(guān)(r = 0.52)。雖然總體上存在正相關(guān)，但該分析表明，有一對(duì)分離株的全基因組距離比例高于或低于它們的16 s距離。但基于16S rRNA的親緣關(guān)系可反映全基因組水平的遺傳差異。
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種內(nèi)多樣性
在某些情況下，單個(gè)物種的分離株形成多個(gè)不同的簇。為了直接檢驗(yàn)種內(nèi)基因組多樣性，使用UMAP分析僅限于注釋的或未注釋的蛋白質(zhì)編碼基因的聚類。結(jié)果表明毛螺菌科某些物種的全基因組存在顯著的多樣性（圖6A）。接下來(lái)，作者研究了在Blautia wexlerae 和活潑瘤胃球菌中，是哪些基因?qū)⒁粋€(gè)物種的分離株分離成不同的簇。比較了Blautia wexlerae或活潑瘤胃球菌的核心基因組，并在單個(gè)簇中識(shí)別出僅是核心基因組的一部分的基因。分析發(fā)現(xiàn)，在Blautia wexlerae和活潑瘤胃球菌簇的核心基因組中分別存在1041和1603個(gè)差異編碼序列。對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，所有B簇的Blautia wexlerae分離株均編碼一些利用纖維二糖的基因，而所有A簇分離株均編碼利用L-半乳糖的基因。類似的地，活潑瘤胃球菌的A簇分離株共享不屬于B或C簇核心基因組的乳糖代謝相關(guān)基因。這些結(jié)果表明，同一物種的分離株在碳水化合物利用能力上存在差異。另外，已經(jīng)確定了幾種可能的機(jī)制，有助于活潑瘤胃球菌與CD和炎癥的關(guān)聯(lián)，包括由一個(gè)30kb操縱子編碼的基因產(chǎn)生促炎癥多糖。為了確定該操縱子是否均勻分布于活潑瘤胃球菌的分離株和簇中，作者將從全基因組中讀取的信息映射到已報(bào)道的操縱子。在分離株中發(fā)現(xiàn)了三種不同的生物合成操縱子覆蓋模式，這表明活潑瘤胃球菌簇中產(chǎn)生這種促炎癥性多糖的能力可能不同。同種不同菌株在基因組序列及碳源利用、產(chǎn)酸水平等方面存在差異，表明種內(nèi)的遺傳多樣性。
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該研究通過(guò)糞便樣本的宏基因組測(cè)序和共生菌株基因組組裝揭示了健康人群中細(xì)菌類群的顯著多樣性，并在一定程度上揭示了細(xì)菌種群之間和內(nèi)部的基因組差異。總的來(lái)說(shuō)，了解單個(gè)分類群(如毛螺菌科)內(nèi)分離株之間的變異程度和類型，將是組裝有效菌群的關(guān)鍵。
