2種建庫方法，分別是Clontech公司推出的SMART法和EpiCentre公司推出的TargetAmp方法。
單細(xì)胞mRNA測序
2個(gè)難題
第一個(gè)難題：PCR偏差
- PCR偏差，就是在PCR擴(kuò)增過程當(dāng)中，某些片段被大量擴(kuò)增。
- 而大部分片段被擴(kuò)增的量很少，甚至根本就沒有被擴(kuò)增。
第二個(gè)難題：去除核糖體RNA
- rRNA在總RNA當(dāng)中占了95%，而mRNA在總RNA當(dāng)中只占2~3%的比例。
SMART法
- SMART方法的全稱是Switching Mechanism at 5’ End of RNA Template
- SMART方法最核心的技術(shù)，就是設(shè)計(jì)了2個(gè)特殊的引物。再配合用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
過程
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逆轉(zhuǎn)錄的起始引物
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保證了逆轉(zhuǎn)錄的起始位置正好是mRNA的3’端的序列終止位置
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MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶在轉(zhuǎn)錄到mRNA的5’端末端的時(shí)侯，會(huì)在新合成的cDNA的3’末端，多加出幾個(gè)C堿基來。
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上游引物特點(diǎn)：3’端是3個(gè)非脫氧的G堿基，也就是核糖核酸的、RNA的G堿基，而不是DNA的G堿基
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之后就是常規(guī)的建庫即可
效果
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法的巧妙點(diǎn)
- （1）引物：保證逆轉(zhuǎn)錄的位置，合成出來的cDNA之后連上通用引物
- （2）酶：利用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶加C堿基的作用，再用有3個(gè)堿基的上游引物進(jìn)行第二鏈的合成，保證了只有完整的第一鏈cDNA才能被合成出cDNA的第二鏈，保證了雙鏈cDNA是全長的；
- （3）保證PCR擴(kuò)增的一致性，因?yàn)閏DNA的5’和3’都引入了一樣的引物，從而保證了PCR擴(kuò)增效率的一致性。
TargetAmp法
TargetAmp的原理圖
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過程
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逆轉(zhuǎn)錄：用T7-Oligo(dT)的引物進(jìn)行cDNA合成
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RNase H酶把cDNA:RNA雙鏈產(chǎn)物中的這個(gè)RNA鏈消化掉
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轉(zhuǎn)錄：利用鏈上的T7啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄出大量的反義RNA來（antisense-RNA，aRNA）
image.png - 純化反義RNA
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逆轉(zhuǎn)錄：隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到第二輪的cDNA
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再用T7-Oligo(dT)這個(gè)引物，粘到第二輪的cDNA的Poly(A)尾巴上，再合成出雙鏈DNA來。
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轉(zhuǎn)錄：這個(gè)雙鏈的cDNA再經(jīng)過第二輪的轉(zhuǎn)錄
image.png - 再經(jīng)過一輪逆轉(zhuǎn)錄
巧妙之處
- 不是用PCR來擴(kuò)增核酸，而是用轉(zhuǎn)錄的方法來增加核酸的量。因?yàn)閿U(kuò)增那么多（倍）的核酸，如果用PCR，要用幾十個(gè)循環(huán)，那么PCR不同的擴(kuò)增子的擴(kuò)增效率，即使一開始是很小的差異，也會(huì)在幾十個(gè)循環(huán)中，被指數(shù)放大，變成一個(gè)很大的差異。
- 統(tǒng)一都用T7這個(gè)統(tǒng)一的啟動(dòng)子，它轉(zhuǎn)錄的啟始效率，大體上就保持了一致。
應(yīng)用
- 循環(huán)腫瘤細(xì)胞研究
- 胚胎發(fā)育研究
- 神經(jīng)活動(dòng)研究
