RNA pull down 流程

1.目的序列載體構(gòu)建；

2.通過PCR方式，在目的序列一端連上T7啟動子；

3.體外轉(zhuǎn)錄目的RNA并標(biāo)記生物素 ；

4.用帶生物素標(biāo)記的RNA探針去拉與該RNA互作蛋白，并通過鏈霉親和素磁珠把RNA-蛋白復(fù)合體富集下來。該pull down過程有兩種方式:

a.RNA探針與蛋白在胞外孵浴結(jié)合，然后用磁珠富集；

b.將RNA探針轉(zhuǎn)染細胞，探針與蛋白在胞內(nèi)結(jié)合，然后裂解細胞并通過磁珠富集。

5.RNA pull down 產(chǎn)物銀染，直觀檢測pull down產(chǎn)物量，及差異條帶；

6.pull down 產(chǎn)物檢測：

a.鑒定目的RNA與哪些蛋白結(jié)合：質(zhì)譜檢測；

b.驗證RNA與某個具體的蛋白是否結(jié)合：WB檢測；

RNA pull down 產(chǎn)物電泳圖
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