本節(jié)就要進(jìn)入更為關(guān)鍵的分析流程了——菌群組成的分析。進(jìn)行16S測(cè)序的目的就是為了研究不同樣本間的菌群組成差異，本節(jié)我們將講解如何用qiime1繪制菌群豐度分布圖、菌群差異分析以及繪制菌群豐度熱圖。
繪制菌群豐度分布圖
菌群分類(lèi)統(tǒng)計(jì)圖能夠展示每個(gè)組或者每個(gè)樣本的菌群比例。在qiime1中用于生成該圖像的命令是summarize_taxa_through_plots.py，該命令具體包括3個(gè)指令：
collapse_samples.py and/or sort_otu_table.py(http://qiime.org/scripts/collapse_samples.html/ http://qiime.org/scripts/sort_otu_table.py)summarize_taxa.py(http://qiime.org/scripts/summarize_taxa.html)plot_taxa_summary.py.py(http://biocore.github.io/emperor/build/html/scripts/plot_taxa_summary.py.html)
其中第一步collapse_samples.py and/or sort_otu_table.py是一個(gè)非必需步驟，主要取決于你是否需要對(duì)樣本進(jìn)行選擇性的展示，如果你只想展示某一部分樣本，或者想要合并某一組的樣本可以使用該命令。
# Plot group average 繪制每組平均值
summarize_taxa_through_plots.py \
-i otu_table.biom \
-o taxa_summary_plots \
-m mapping_file.txt \
-c SampleType
# Plot each sample 繪制每個(gè)樣本
summarize_taxa_through_plots.py \
-i otu_table.biom \
-o taxa_summary_plots \
-m mapping_file.txt
最后會(huì)產(chǎn)生一個(gè)文件夾。其中有一個(gè)網(wǎng)頁(yè).html會(huì)展示所有的圖片結(jié)果，你也可以在文件夾中找到原始的圖片。
豐度差異的檢驗(yàn)
通過(guò)繪制菌群豐度分布圖后，你大致了解了樣本中豐度較高的菌群主要有哪些。那么接下來(lái)，你肯定會(huì)好奇在你的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中究竟有哪些OTU存在顯著差異。Qiime1提供了檢測(cè)差異的命令，當(dāng)然你也可以使用其他非常流行的方法比如LEfSe。之后我們會(huì)對(duì)如何使用LEfSe進(jìn)行講解，本節(jié)我們先講解如何使用Qiime1自帶的命令進(jìn)行檢驗(yàn)比較。
Qiime推薦了兩種方法，第一種是geroup_significance.py
group_significance.py \
-i otu_table.biom \
-o kruskal_wallis_test.txt \
-m mapping_file.txt \
-c SampleType \
-s kruskal_wallis
其中-s方法可以選擇下述檢驗(yàn)方法：nonparametric_t_test, bootstrap_mann_whitney_u, ANOVA, kruskal_wallis, g_test, parametric_t_test, mann_whitney_u
另外一種是利用DESeq2進(jìn)行更加深入的差異檢驗(yàn)（做過(guò)RNA-seq分析的人一定對(duì)這個(gè)名字DESeq2不陌生）。具體如下：
differential_abundance.py
-i otu_table.biom
-o diff_otus.txt
-m mapping_file.txt
-a metagenomeSeq_fitZIG
-c Treatment
-x Control
-y Fast
其中-c是告訴程序需要比較哪一項(xiàng)，比如在此處我們想要比較不同Treatment的差異，其中Treatment有兩組Control和Fast，所以告訴程序-x是Control組，-y是Fast組。
想要知道這兩個(gè)命令更為詳細(xì)的信息可以查看：
group_significance.py：
http://qiime.org/scripts/group_significance.html
differential_abundance.py：
http://qiime.org/scripts/differential_abundance.html
樣本豐度歸一化
除了使用相對(duì)豐度對(duì)樣本進(jìn)行歸一化，Qiime1還提供了DESeq2和CSS這些歸一化方法。經(jīng)過(guò)歸一化的樣本更加適合進(jìn)行fitZIG和DESeq2的差異檢驗(yàn)。
normalize_table.py \
-i otu_table.biom \
-o otu_table_deseq2_normalized.biom \
-a DESeq2
繪制豐度熱圖
熱圖是一種直觀(guān)的展示各個(gè)樣本不同菌群豐度的形式。Qiime1也可以直接制作熱圖。
make_otu_heatmap.py \
-i otu_table.biom \
-o heatmap_sorted.pdf \
-m mapping_file.txt \
-t rep_set.tre
