在經過一段時間對單細胞轉錄組和空間轉錄組相關技術的了解，我認為對兩項技術在生物領域的應用有了一定的認知。本周我選擇從植物領域入手，選擇了華大在今年五月份于Developmental Cell在線發(fā)表的擬南芥葉片空間單細胞的一個關聯分析研究。接下來我?guī)Т蠹乙黄鹫J知和解讀這篇文獻吧。
一、文章簡介
文章題目：單細胞空間轉錄組測序揭示擬南芥葉片中特定區(qū)域的細胞亞型和轉錄組圖譜
期刊：Developmental Cell?IF：13.417
發(fā)表機構：深圳華大生命科學研究院
二、主要內容
研究者通過對6周齡的擬南芥莖生葉進行了取樣、實驗和測序分析，在驗證scStereo-seq技術在植物樣本中應用的可靠性的同時，分析了擬南芥葉片中不同基因的空間表達變化以及不同細胞群體的空間發(fā)育軌跡，描繪了葉片中不同細胞類型的轉錄組空間變化。
研究的內容主要包括以下幾點：
l 利用stero-seq技術建立植物單細胞空間轉錄組圖譜
l 鑒定細胞亞型和細微的轉錄差異
l 從主脈到葉緣細胞類型差異基因的表達
l 構建擬南芥空間圖譜來分辨維細胞發(fā)育軌跡
三、材料與方法
研究樣本：樣本為6周齡的擬南芥莖生葉，擬南芥品種為野生型Columbia-0。
研究策略：基于華大自主研發(fā)的時空組學技術Stereo-seq，深圳華大生命科學研究院結合植物樣本擁有細胞壁這一特性，針對技術流程進行了優(yōu)化和改良，建立了一套適用于植物的單細胞級的空間轉錄組技術流程scStereo-seq，并將其示范應用于擬南芥葉片的時空組學研究中。
Stereo-seq技術的建立和應用（圖1）：
① CID經滾環(huán)擴增后形成DNA納米球（DNB）
②DNB落入芯片上的spot位點，經測序得到CID序列及空間坐標
③ 通過生化合成將CID與MID分子和捕獲探針（Oligo-dT）相連接
④ 組織切片貼片后透化并釋放mRNA
⑤ 芯片對組織上的mRNA進行原位捕獲，經擴增后建庫測序
圖1 scStereo-seq技術原理示意圖
實驗方法：
① 對擬南芥葉片進行冷凍切片，使用直徑為220nm, 間距為715nm的DNA納米球（DNB）陣列來捕獲mRNA信息。
② 對切片進行細胞壁染色呈像，使用stereo-seq技術對11片葉子進行測序實驗。
③ 確認測序確認質量達到要求，MID 的分布可以在組織區(qū)域和背景區(qū)域間明顯區(qū)分開來。
④ 對細胞壁進行了甲苯胺藍(TB)染色，以顯示細胞間的邊界。
⑤ 將染色圖像和測序數據合并，利用套索工具根據細胞壁邊界手工提取單細胞，并與MID計數相配合，獲得每個單細胞的具體數據。
四、研究結果
1、scStereo-seq技術的建立和應用
基于Stereo-seq技術，研究者建立了適用于植物的單細胞空間轉錄組技術（scStereo-seq），并將其應用于植物葉片樣本研究中（圖2A）。通過取樣、實驗和分析篩選，研究人員篩選出來26個擬南芥葉片樣本進行了整合以及基礎數據集的構建，通過質控和過濾，總共獲得了13,950個單細胞數據用于后續(xù)分析，包括5,139個表皮細胞、7,490個葉肉細胞、377個保衛(wèi)細胞和944個維管束細胞。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖2 擬南芥莖葉單細胞水平空間轉錄組的分析
2、單細胞水平上鑒別細胞類型間的轉錄組差異
在獲得高質量高數據量的葉片空間數據（圖2A）后，研究者首先對scStereo-seq技術在植物樣本中應用的可靠性進行了驗證。通過marker基因的檢驗和可視化、單細胞聚類分析、主要細胞類型鑒定和功能分析等方法多方面地進行了分析，結果發(fā)現scStereo-seq技術能夠提供高清的細胞內轉錄組特征，對不同細胞類型的鑒定具有較高的分辨率（圖3C、2E、2F）。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖3 不同細胞類型的技術再現性和轉錄組多樣性
3、評估scStereo-seq技術在植物樣本中應用的可靠性
在過往的植物單細胞研究中，部分細胞亞型特征高度相似而難以通過單細胞等技術得到有效地區(qū)分和研究（如表皮細胞中的上、下表皮細胞，葉肉細胞中的柵欄細胞和海綿細胞），而scStereo-seq技術可以在獲得單細胞空間表達數據的同時，根據切片的圖像信息對切片樣本中形態(tài)清晰的細胞進行鑒定和注釋。通過將空間信息與轉錄組數據結合分析，成功將表達相似的上、下表皮細胞（圖4C），以及柵欄細胞、海綿細胞區(qū)分開來，并對這些相似細胞類型間的差異和功能（圖4D、4E）進行了研究。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖4 細胞類型和細胞亞型轉錄組特征的驗證和研究
4、解析從主脈到葉緣細胞類型差異基因的表達
為了探究基因的空間表達差異，研究人員從葉片中間向兩端的方向劃分成了4個區(qū)域（0區(qū)為主葉脈，3區(qū)為葉邊緣），并以此為基礎在細胞中進行了基因表達模式分析（圖5A），結果表明，光合作用效率從主葉脈到葉緣逐漸增加，而主葉脈的主要角色是與物質運輸相關（圖5B~4D）。鑒于光合作用過程主要發(fā)生在葉肉細胞當中，研究人員又進一步對葉肉細胞中的基因表達模式進行了分析，分析結果與之前的分析一致。有意思的是，葉肉細胞的pattern2和pattern 3的基因顯著富集于物質運輸與高滲機械刺激等反饋相關的GO中，表明0區(qū)的葉肉細胞與維管細胞之間可能存在較為頻繁的物質交換（圖5E~5G）
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖5 擬南芥葉片橫截面上的基因表達模式
5、解析不同類型細胞的空間發(fā)育軌跡
已有研究表明，葉脈與葉邊緣的細胞存在分化上的差異，但不同類型細胞的具體發(fā)育模型還不清楚，通過擬時序分析，研究人員發(fā)現在維管細胞中，主葉脈區(qū)域的細胞相較于葉緣其分化程度更低，擁有更高的多功能干性（圖6A~6C）。而在表皮和保衛(wèi)細胞中，保衛(wèi)細胞顯著富集于發(fā)育軌跡的一支，但它們在空間上沒有表現出明顯差異（圖6D~6F）。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖6 血管細胞和保衛(wèi)細胞的空間分辨發(fā)育軌跡
五、研究總結
這篇文章總體而言是一篇技術推廣文章。主要目的是證明了華大開發(fā)的scStereo-seq時空轉錄組技術的可用性。通過在擬南芥葉片中運用scStereo-seq技術，證明單細胞分辨率的空間轉錄組技術其有利于細胞類型的識別和細胞轉錄特征的鑒定。其中利用空間信息和基于圖像的單細胞分割有利于細胞亞群的鑒定，給我們在植物上將單細胞和空間技術進行整合提供了借鑒。
