大多數(shù)蛋白質(zhì)凝膠電泳是還原性條件下的十二燒基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE) 。
＊樣品準(zhǔn)備
還原試劑2－巰基乙醇或者二硫蘇糖醇加在變性膠的樣品緩沖液中，還原蛋白質(zhì)中的二硫鍵，確保蛋白質(zhì)維持在測定分子量所需的無規(guī)則卷曲狀態(tài)。
樣品緩沖液分成小管，貯于－20℃ 。甘油濃度很高，足以防止樣品凍結(jié)，所以不必?fù)?dān)心凍融所造成的損傷。當(dāng)管中沒有還原試劑的味道時，就該取用一管新的還原試劑了。
SDS-PAGE: 2 x 緩沖液包含4% SDS 、20% 甘油、10% 2－巰基乙醇（或100 mmol/L二硫蘇糖醇），0.004% 溴酚藍(lán)， 0.125mol/L Tris-HCI, pH 近似于6.8 。
樣品必須在即將上樣之前，在樣品緩沖液中煮沸（或95℃ 加熱）5min 。如果在燒杯或者水浴鍋中加熱，使用漂浮管架。必要時，可以用苯乙烯塑料，戳上幾個洞即可。煮沸后管子置于冰上冷卻。打開蓋子時，緊緊抓住管子，萬一管內(nèi)壓力沒有完全釋放，可以防止蓋子彈出。
如果蓋緊蓋子煮樣品，蓋子有可能彈開，整個管子可能爆到空中。有幾種方法可以避免這種情況：可以等到樣品即將開始爆炸時，輕輕打開管子釋放壓力；可以用針在每個管子蓋上戳一個小孔，但這不能用于放射性樣品。有幾種煮樣品用的架子，
可以將小管子的蓋子緊緊夾住， 防止它彈開。最佳解決之道是使用一個塑料夾子，套緊小管的蓋子防止其彈開。
＊標(biāo)準(zhǔn)參照物／分子質(zhì)量標(biāo)記
標(biāo)準(zhǔn)參照物有高范圍、低范圍以及寬范圍的。市售的有未染色的或預(yù)染色的，預(yù)染色的更方便使用。除非另有說明，標(biāo)準(zhǔn)參照物應(yīng)貯于－20 ‘C 。
染料與標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量標(biāo)記的共價結(jié)合使蛋白質(zhì)分子質(zhì)量產(chǎn)生變化。要精確測定分子質(zhì)量應(yīng)使用經(jīng)校準(zhǔn)的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照。
生物素化的標(biāo)準(zhǔn)參照可以引入到免疫印跡的辣根過氧化物酶(HRP) 或堿性磷酸酶檢測步驟中。其他標(biāo)記參照是設(shè)計用于銀染或其他染色方法的。
大多數(shù)的標(biāo)記參照是為SDS- PAGE 設(shè)計的。如果是非變性膠，必須使用用于非變性膠的標(biāo)記參照。
＊樣式
聚丙烯酰胺凝膠總是倒在兩塊玻璃板之間。兩塊玻璃板有間隔片分開。間隔片有不同的厚度，與相同厚度的梳子配套使用。
連續(xù)膠VS非連續(xù)膠。連續(xù)膠系統(tǒng)有一塊在陰極與陽極之間使用同一種緩沖液的分離膠。非連續(xù)膠分兩個部分：濃縮膠（大孔膠）鋪陳于分離膠之上。在非連續(xù)膠系統(tǒng)中，陰極與陽極之間使用不同的緩沖液。非連續(xù)膠系統(tǒng)的分辨率好。
雙向凝膠用來更精確地分析蛋白質(zhì)，樣品電泳兩次，分別被稱為第一相與第二相。第一相是一個等電聚焦凝膠(IEF) ，一般以管狀膠的形式電泳，以確定各蛋白質(zhì)的等電點。然后將膠放置在板狀膠的上面以備第二相電泳，根據(jù)分子質(zhì)量大小電泳后使蛋白質(zhì)得到分開。
管狀凝膠VS板狀凝膠。管狀凝膠曾經(jīng)用于一般電泳，現(xiàn)在僅用于雙向電泳的第一相。
＊凝膠
38 : 1 （聚丙烯酰胺BIS 的質(zhì)量比）質(zhì)量比是蛋白質(zhì)凝膠制膠所用貯液的通常比例。制膠時，取用不同的38 : 1 混合物的量，以制得不同丙烯酰胺濃度的膠。
梯度膠或非梯度膠。非梯度膠的丙烯酰胺就一個百分比濃度，能將一個條帶與周圍條帶分開，適于觀察分子量相近的兩條條帶。梯度膠則能將大分子量的條帶與小分子量的條帶在同一塊膠上得到分離。
變性膠或非變性膠。因為蛋白質(zhì)是兩性化合物，它們的凈電荷是由所處環(huán)境的pH 值決定的。根據(jù)蛋內(nèi)質(zhì)的pKa 與周圍介質(zhì)的pH
值某蛋白質(zhì)會被吸引到陰極或者陽極。因此，在非變性條件下，蛋白質(zhì)的電泳分離是由該蛋白質(zhì)的大小與電荷共同決定的，在變性條件下的分離只由大小決定。
SDS-PAGE。SDS 是陰離子型去污劑，使蛋白質(zhì)變性帶上負(fù)電荷。在變性條件下電泳，電荷不再是一個影響囚素，蛋白質(zhì)的電泳遷移只依賴于分子質(zhì)量。
＊緩沖液
大多數(shù)蛋白質(zhì)凝膠應(yīng)用甘氨酸-Tris 緩沖液(196 mmol/L 甘氨酸／ 0 . 1 % SDS/50mmol/L Tris-HCI, pH 8.3) 。配制至少2L 的l0 X 緩沖液，室溫保存。
Tricine ［ 三（輕基）甲基甘氨酸］緩沖液用于肽與小蛋白質(zhì)(2~80 kDa) 的電泳。
＊電源
25~30 mA (200V) 條件下電泳。通常在染料前沿到達(dá)膠的底部時停止電泳。
蛋白質(zhì)穿行于濃縮膠時，電泳要慢一點，低于50 V 。一旦樣品處于濃縮膠與分離膠的界面時，可以調(diào)高電壓至200 V 。
＊染色
電泳之后凝膠的染色是與染色液一起溫浴，然后多次洗滌以除去多余染料。
最常用的染色液是0.2% 考馬斯亮藍(lán)，在45 : 45 : 10 的甲醇：水： 乙酸混合液中37℃搖染2~3 個小時。用25 ：65: 10 的甲醇：水：乙酸脫色。
銀染是更靈敏的染色方法，用于考馬斯亮藍(lán)染色很淡或根本不染色的蛋白質(zhì)的染色。使用起來也更復(fù)雜。
