隨著測序成本的不斷下降，轉(zhuǎn)錄組測序分析已然成為生物學及醫(yī)學研究不可或缺的技術手段。
重點介紹一下轉(zhuǎn)錄組測序分析的相關知識。
Question and Answer
1、什么是轉(zhuǎn)錄組測序？
轉(zhuǎn)錄組廣義上指在某一生理條件下，細胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)物的集合，包括：mRNA、ncRNA、rRNA等；狹義上指所有mRNA的集合。
轉(zhuǎn)錄組測序的研究對象為特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，主要包括mRNA和ncRNA。
轉(zhuǎn)錄組具有時間特異性、組織特異性、空間特異性等特點。
2、無參轉(zhuǎn)錄組和有參轉(zhuǎn)錄組的區(qū)別？
如果所研究的物種有組裝注釋質(zhì)量較好基因組序列，且和該基因組序列比對效率較高，那么可以采用有參轉(zhuǎn)錄組的分析策略，直接進行分析。反之，則需要按照無參轉(zhuǎn)錄組的分析策略進行轉(zhuǎn)錄本組裝，構建unigene庫，然后進行后續(xù)分析。
3、普通轉(zhuǎn)錄組測序適用于哪些情況？
普通轉(zhuǎn)錄組測序主要適用于兩大類：一是不同的生長階段或者發(fā)育過程；二是不同的環(huán)境、藥物、病原菌等逆境脅迫處理。
4、轉(zhuǎn)錄組測序推薦的測序數(shù)據(jù)量？
轉(zhuǎn)錄組測序所需數(shù)據(jù)量與所研究物種的基因組大小有關，基因組越大，則所需數(shù)據(jù)量越大。按照我們的經(jīng)驗來說：
常規(guī)物種一般建議6G數(shù)據(jù)即可；
基因組較大的物種推薦8G以上數(shù)據(jù)，比如：小麥建議10G數(shù)據(jù)起，甘蔗、甘薯建議至少8G數(shù)據(jù)。
5、轉(zhuǎn)錄組測序的取樣建議？
取樣要遵守三個原則：代表性和一致性原則、迅速性原則、低溫原則。具體可以參考小編之前發(fā)的一篇推文《高通量測序及蛋白組學相關樣品準備須知》藍字為鏈接可點擊。
6、轉(zhuǎn)錄組測序必須做生物學重復么？需要幾個重復？
生物學重復是生物實驗所必須的，轉(zhuǎn)錄組測序也不例外，至少3 次生物學重復。
準備生物重復樣品時，通過對實驗的預先設計和控制，盡可能將與實驗處理無關的背景條件控制在同一水平，減少批次效應對結果的影響。
7、轉(zhuǎn)錄組測序可以同時測到mRNA、lncRNA、micRNA以及circRNA么？
我們通常所講的轉(zhuǎn)錄組測序只能測到mRNA。但是全轉(zhuǎn)錄組測序通過構建兩個測序文庫（一是小RNA測序文庫、二是lncRNA測序文庫）是可以測到以上4種RNA的。
8、有參轉(zhuǎn)錄組測序分析中，與參考基因組的比對效率多高才能夠滿足后續(xù)分析？
與參考基因組的比對效率與多個因素有關，包括基因組組裝質(zhì)量、測序質(zhì)量、有無污染等；一般來說，與參考基因組的比對效率在70%以上時，該基因組可以滿足后續(xù)的分析需求。當比對效率低于60%時，需要考慮換參考基因組或者按照無參轉(zhuǎn)錄組分析策略進行分析。
9、所研究物種有參考基因組時，必須按照有參的來分析么？
按照有參或者無參進行轉(zhuǎn)錄組分析，取決于基因組的質(zhì)量、所研究物種與參考基因組的比對效率。具體如下：
若參考基因組質(zhì)量較差，則可以選擇按照無參轉(zhuǎn)錄組分析策略進行分析；
若所研究物種與參考基因組比對效率比較低，則需要按照無參轉(zhuǎn)錄組分析策略進行分析。
10、做完轉(zhuǎn)錄組之后一定要進行Q-PCR驗證么？一般驗證多少個差異基因合適？
目前來說，Q-PCR驗證是轉(zhuǎn)錄組測序分析必不可少的補充驗證實驗，發(fā)文章必須。一般驗證15-20個差異基因比較合適。
11、Q-PCR與轉(zhuǎn)錄組測序結果的吻合度一般多高是合適的？為什么會出現(xiàn)不吻合的現(xiàn)象？
Q-PCR與有參轉(zhuǎn)錄組分析結果的吻合度在80%以上；Q-PCR與無參轉(zhuǎn)錄組分析結果的吻合度在70%以上。
出現(xiàn)結果不吻合現(xiàn)象的原因如下：實驗所用樣本弄混；沒有使用與轉(zhuǎn)錄組測序同一批的樣本進行Q-PCR驗證；挑選的基因表達量較低或差異不顯著。
12、轉(zhuǎn)錄組測序的后續(xù)補充分析有哪些？
做完轉(zhuǎn)錄組測序可以考慮以下分析內(nèi)容做為補充，用于提高文章檔次和深度。
可變剪接的深入分析（對生信基礎要求較高）
基因家族分析（基因家族分析發(fā)SCI-多、快、好、省！）藍字為鏈接可點擊
WGCNA分析（你距離SCI文章只差一個WGCNA分析）藍字為鏈接可點擊
其他分析（參考其他人的高分文章，整理自己的個性化分析思路）
13、有參轉(zhuǎn)錄組測序分析的結果文件中有全部基因的cds序列么？在哪個文件中？
一般來說結果文件中有全部基因的cds序列。我公司有參轉(zhuǎn)錄組分析結果中的基因cds序列信息位于Gene_Func_Anno文件夾下面的NewGene中的All.longest_transcript.fa文件里。
14、轉(zhuǎn)錄組測序分析常用的數(shù)據(jù)庫有哪些？重點關注哪些注釋信息？
Nr：NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫，包含的信息很全面,?注釋到的基因較多。
COG?：中文釋義即“同源蛋白簇”。COG?分為兩類，一類是原核生物的，另一類是真核生物。原核生物的一般稱為?COG?數(shù)據(jù)庫；真核生物的一般稱為?KOG?數(shù)據(jù)庫。
SWISS-PROT：經(jīng)過注釋的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)的功能經(jīng)過了試驗驗證，注釋是精確的；
TrEMBL：數(shù)據(jù)庫全稱“Translation of EMBL”，是從EMBL中的cDNA序列翻譯得到的，其中TrEMBL收錄的是未經(jīng)人工注釋的編碼DNA序列翻譯數(shù)據(jù)；
KEGG：翻譯成中文是京都基因與基因組百科全書，是一個整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫，旨在揭示生命現(xiàn)象的遺傳與化學藍圖。它是由人工創(chuàng)建的一個知識庫，KEGG數(shù)據(jù)庫最優(yōu)的地方在于擁有描繪已知通路的代謝通路圖。另外KEGG中有一個“專有名詞”KO（KEGG Orthology），它是蛋白質(zhì)（酶）的一個分類體系，序列高度相似，并且在同一條通路上有相似功能的蛋白質(zhì)被歸為一組，然后打上KO（或K）標簽，一般用字母K后面加5個數(shù)字表示。KEGG_ID?是pathway的ID，表示方法是2-4個字母，后面跟上5個數(shù)字；
GO（gene ontology）：是基因本體聯(lián)合會（Gene Onotology Consortium）所建立的數(shù)據(jù)庫，旨在建立一個適用于各種物種的，對基因和蛋白質(zhì)功能進行限定和描述的數(shù)據(jù)庫。按照三大類別BP（生物學過程）、 MF（(分子功能）、CC（細胞組分）對基因的產(chǎn)物-蛋白質(zhì)進行了分類，并能隨著研究不斷深入而更新的語言詞匯標準。在GO數(shù)據(jù)庫中，本質(zhì)上是一個有向無環(huán)圖的數(shù)據(jù)結構，在三大類別之下，又有小的分類層級，一層一層的分類下去。對于某個具體的GO號來說，代表一組同源蛋白，擁有相似的結構和功能；
Pfam：是一個被廣泛使用的蛋白家族數(shù)據(jù)庫，它有兩個數(shù)據(jù)庫，高質(zhì)量，手工確定的Pfam-A，自動注釋的Pfam-B數(shù)據(jù)庫。
15、差異分析的篩選標準默認是多少？是固定不變的么？
差異分析的篩選標準默認為：Fold Change≥2且FDR<0.01。篩選條件要靈活，要根據(jù)情況進行參數(shù)調(diào)整，數(shù)據(jù)是死的，人是活的，要靈活變通。
16、unigene和轉(zhuǎn)錄本的區(qū)別？
unigene是轉(zhuǎn)錄本的子集。首先通過triniy組裝出來的視為轉(zhuǎn)錄本，然后挑選最長的一條轉(zhuǎn)錄本作為unigene。
17、差異基因太多，注釋信息太雜亂，怎么挑選目標基因？
可以根據(jù)KEGG和GO富集分析結果，挑選富集程度較高的代謝通路和GO terms，進而查看相關的差異基因；
對不同的差異組合進行維恩圖分析，挑選共有或者特有的差異基因作為后續(xù)的研究對象；
根據(jù)前人的文獻報道，挑選相關差異基因，不要局限在自己研究的物種上。
18、為什么原核物種只能做有參轉(zhuǎn)錄組分析？
由于原核生物的基因組中存在大量基因重疊區(qū)域、操縱子及多順反子，如果按照無參轉(zhuǎn)錄組分析策略進行組裝的話，難度較大，組裝結果存在較大風險。
19、差異基因數(shù)目多少比較合理？
