最近打算測一些干燥材料和標(biāo)本材料的淺層基因組，有些材料降解嚴(yán)重，拼接的過程可能會比較困難。由于我們的目標(biāo)主要是轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，所以試試看能不能在拼接之前將與轉(zhuǎn)錄組無關(guān)的序列直接在原始測序數(shù)據(jù)中刪除。
minimap2和samtools安裝都比較簡單，這里就不行詳細(xì)介紹了。
1.參考數(shù)據(jù)建庫
首先我們選擇一個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行建庫作為參考的比對序列
minimap2 -d 007.min 007_trinity.fasta
# 007.min為建立的索引庫的名稱， 007_trinity.fasta為準(zhǔn)備的參考fasta序列文件
這樣就建立了一個參考庫
2.比對
minimap2 -ax map-ont 007.min 128_1.fq.gz -o 128_1.sam
# 007.min 是參考庫， 128_1.fq.gz是需要篩選的基因組原始數(shù)據(jù)，128_1.sam 是輸出的文件
minmap2 的常用參數(shù)
主要分成五大類，索引（Indexing），回帖（Mapping），比對(Alignment),輸入/輸出（Input/Output）,預(yù)設(shè)值（Preset）。
-x ：非常中要的一個選項，軟件預(yù)測的一些值，針對不同的數(shù)據(jù)選擇不同的值
map-pb/map-ont: pb或者ont數(shù)據(jù)與參考序列比對；
ava-pb/ava-ont: 尋找pd數(shù)據(jù)或者ont數(shù)據(jù)之間的overlap關(guān)系；
asm5/asm10/asm20: 拼接結(jié)果與參考序列進(jìn)行比對，適合~0.1/1/5% 序列分歧度；
splice: 長reads的切割比對
sr: 短reads比對
-d :創(chuàng)建索引文件名
-a ：指定輸出格式為sa格式，默認(rèn)為PAF
-Q ：sam文件中不輸出堿基質(zhì)量
-R ：reads Group信息，與bwa比對中的-R一致
-t：線程數(shù)，默認(rèn)為3
-o: 輸出文件
3使用samtools處理sam文件
sam文件（上一步得到的那種文件）是一種列表格式，用來記錄reads比對到參考基因組上的信息，包括哪一條reads，比對到哪條基因組上的哪個位置，是一對一比對還是一對多比對，有無錯配，錯配是怎樣的。因此就需要包含很多列的信息，下面具體展示sam格式。
第一列：是reads ID
第二列：是flag標(biāo)記的總和
第三列：比對到參考序列上的染色體號。
第四列：為在參考序列上的位置
第五列：比對的質(zhì)量值，MAPQ
第六列：代表比對結(jié)果的CIGAR字符串
第七列：mate比對到的染色體號，若是沒有mate，則是*
第八列：比對到參考序列上的第一個堿基位置
第九列：Template的長度，
第十列：為read的序列
第十一列：為ASCII碼格式的序列質(zhì)量；
比對得到的sam或者bam不能直接用于下游的數(shù)據(jù)處理，需要進(jìn)行很多處理。主要包括轉(zhuǎn)換為bam，排序，合并不同lane的數(shù)據(jù)，對bam文件加頭部信息等操作。而這些工作都可以使用samtools工具來進(jìn)行操作。samtools顧名思義，是處理sam格式的工具合集。samtools主要包含以下幾大功能：Indexing 建立索引，Editing 編輯文件，F(xiàn)ile operations，Statistics，統(tǒng)計相關(guān)功能；Viewing，查看，等
常用參數(shù)：
samtools選項參數(shù)：
-o：輸出結(jié)果文件
-O：輸出文件格式
-@：線程數(shù)目
--reference：參考序列
詳細(xì)操作不講了，直接提取需要的目標(biāo)序列
samtools fasta -F 4 128_1.sam > 128_1.minimap2.fasta
# -F 4 參數(shù)表示提取出比對上的序列， -f 4 則是提取未比對上的序列。
最后得到一個fasta文件，使用這個fasta文件就可以進(jìn)行下一步的序列拼接了。
之后使用Trinity進(jìn)行拼接測試，但是總是運(yùn)行一段時間就莫名其妙的斷掉了，也沒有任何報錯信息，后來將輸出的fasta文件改成fastq文件之后可以正常拼接，輸出fastq的命令問
samtools fastq -F 4128_1.sam > 128_1.minimap2.fastq
