空間轉錄組簡介-2022-07-04

空間轉錄組學簡介

原理

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  • step1：新鮮冷凍組織切片成像

    • 冷凍組織不能直接用液氮，急速降溫會導致細胞損傷，10X建議用OTC包埋的異戊烷速凍組織：
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  • step2： 放置在包含與RNA結合的捕獲探針的陣列上

  • step3：組織固定并透化 釋放RNA，與相鄰的捕獲探針結合 ==> 捕獲基因表達信息

  • step4：捕獲的RNA與空間條形碼捕獲探針相結合，==> 捕獲的mRNA合成cDNA，制備測序文庫

  • step5：對文庫測序并可視化數據

步驟

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  • 對經過OTC包埋的新鮮冷凍組織切片，放置到捕獲區(qū)域上

  • （用甲醇）對組織進行固定、H&E染色、拍攝明場圖片

  • 組織透化

  • 反轉錄&&建庫測序：釋放的mRNA的ployA尾結合探針的oligo（dT），反轉錄cDNA ==> cDNA擴增、純化和質控 ==>片段化、末端修復、加A和連接頭 ==> 樣本indexPCR，建庫測序

  • 測序文庫：
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    • 備注：
      • 使用雙重索引，i5 && i7
      • 對read2的長度有要求

樣本質控

實驗質控標準

  • Rin：RNA完整度 > 7
  • 組織樣本切片完整且不褶皺

關于組織優(yōu)化（tissue optimization）

  • 目的：尋找一個最佳條件（可能是透化時間），使得組織樣本中mRNA能被最大化充分釋放
  • 判斷是否優(yōu)的方法
    • 組織染色==> 透化 ==> cDNA合成時，再dNTP上有SN3熒光基團，通過熒光顯微鏡判斷哪個實驗條件下的組織切片釋放的mRNA量最多
  • 組織透化
    • 不同組織的細胞組成及空間構成存在明顯異質性，在進行正式空間轉錄組建庫實驗前，對每種組織類型進行透化實驗，摸索最佳的條件。選擇熒光強度最亮的作為正式實驗的透化條件

10X透化與建庫

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slide結構

  • 4個Capture Area（6.5*6.5mm，每個區(qū)域含有5000個被條形碼標記的點（barcoded spots））
  • 每個Capture Area尺寸為6.5mm x 6.5mm
  • Capture Area中總共有約5000個capture mRNA的點
  • 每個capture mRNA的點上有百萬個oligo
  • 每個capture mRNA的點，點的直徑為55μm，點與點之間的中心距離為100μm

每個oligo結構

  • read1
  • Sptial barcode：用于回溯空間位置信息
  • UMI：用于無偏計數分析
  • oligo（dT）：用于捕獲真核生物RNA的ployA尾巴

關于數據分析

  • 所處步驟：切片==> 透化 ==> 建庫測序 ==> 數據分析

10X與BGI

  • 10X：
    點的直徑為55μm，點與點之間的中心距離為100μm

參考

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