舊號無故被封，小號再發(fā)一次

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一、目的

細胞及其在組織內(nèi)的組織之間的關(guān)系對于理解正常發(fā)育和疾病病理至關(guān)重要。Visium空間基因表達解決方案可測量完整組織切片中的總mRNA，并繪制出現(xiàn)基因活性的位置的圖。

簡單說，就是將基因的表達情況與切片染色圖結(jié)合起來，在一個空間的維度上去理解基因表達的分布情況

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二、解決方案

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包括：

• 試劑
• 耗材
• 信息分析軟件

自己實驗室需要配備：

• 冰凍切片機
• 熒光顯微鏡

三、技術(shù)發(fā)展

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• 分辨率提升，有8w個UMI capture area，5000個點
• 每個點可以覆蓋1~10個細胞

四、新技術(shù)特點

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四、原理

出于組織學目的，對新鮮冷凍的組織切片進行成像，并將其放置在包含與RNA結(jié)合的捕獲探針的陣列上。將組織固定并透化以釋放RNA，使其與相鄰的捕獲探針結(jié)合，從而捕獲基因表達信息。然后從捕獲的RNA合成cDNA，并制備測序文庫。然后對文庫測序并可視化數(shù)據(jù)，以確定表達哪些基因，在何處表達以及表達多少。

五、流程概述

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• 新鮮的冰凍組織
• H&E染色 + 熒光顯微鏡掃描
• 測序
• 信息分析

PS：對于新的組織樣本等情況，在正式建庫前需要進行組織優(yōu)化

組織優(yōu)化：（非必須）

目的：找到一個最佳的條件（可能是透化時間的長短），使組織樣本中的mRNA能被最大化充分地釋放出來

由此產(chǎn)生了一個試劑盒TOkit（組織優(yōu)化試劑盒）和 GEX slide(Gene Expression試劑盒) 基因表達試劑

六、兩種試劑盒

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• TO kit (Tissue Optimization)組織優(yōu)化試劑盒
  • 可通過8個Capture Area對同一個樣本設(shè)置8個不同的優(yōu)化條件（例如透化時間等）
  • 一個包裝4張slide,可做四種不同樣本的優(yōu)化測試
• GEX slide(Gene Expression試劑盒) 基因表達試劑
  • 每張slide有4個Capture Area
  • 兩種規(guī)格：一張silde(4個反應(yīng)） 或 4張slide（16個反應(yīng)）

七、實驗流程

1. 組織優(yōu)化（可選）

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- slide上的oligo上沒有相應(yīng)的barcode
- 目的只是幫我們找到組織釋放出最多mRNA的實驗條件
- 對組織進行染色、透化之后，進行cDNA合成，而在dNTP上有SN3的熒光基團，便可通過熒光顯微鏡進行判斷哪個實驗條件下的組織切片所釋放mRNA量最多

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• 1號為陰性對照
• 不同樣本的透化時間都不相同

2. 透化與建庫

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• slide的結(jié)構(gòu)

  • 4個Capture Area
  • 每個Capture Area尺寸為6.5mm x 6.5mm
  • Capture Area中總共有約5000個capture mRNA的點
  • 每個capture mRNA的點上有百萬個oligo
  • 每個capture mRNA的點，點的直徑為55μm，點與點之間的中心距離為100μm

• 每個oligo結(jié)構(gòu)：

  • read1
  • Sptial barcode： 用于回溯空間位置信息
  • UMI ： 用于無偏計數(shù)分析
  • oligo(dT)： 用于捕獲真核生物RNA的PolyA尾巴

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• 對經(jīng)過OTC包埋的新鮮冷凍組織進行切片，并將之放置捕獲區(qū)域上
• （用甲醇）對組織進行固定、H&E染色，拍攝明場圖片
• 對組織進行透化
• 釋放出的mRNA的PolyA尾結(jié)合探針的oligo(dT)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA
• cDNA擴增、純化和質(zhì)控；
• 片段化，末端修復(fù)，加A和連接頭；
• 樣本index PCR， 制備測序文庫。
• 最后進行上機測序

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• 注意：應(yīng)用了雙重索引，i5和i7

• 而且對read2的長度也很有要求

  
  
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已經(jīng)經(jīng)過測試的樣本：

• 小鼠與大鼠

  
  
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• 人類

  
  
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  比較難操作的樣本：

  
  
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八、分析流程

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• Cell Ranger1.0.0
  • cellranger makefastq
  • cellranger count
• Loupe Browser4.0.0
  • 可視化

九、結(jié)果展示

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十、自己的一些思考

• 加上了雙重索引、載玻片上的探針，還有捕獲區(qū)域上的對齊邊框，既優(yōu)化了性能，又使得這項技術(shù)已經(jīng)很難再用其他廠商的試劑盒替代，太會玩了。

學習自10X官網(wǎng)

• https://www.10xgenomics.com/spatial-transcriptomics/