在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，雙熒光素酶報告基因（Dual-LUC）實驗技術(shù)是應(yīng)用廣泛的核心實驗手段之一。

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灱夹g(shù)以螢火蟲熒光素酶（Firefly Luciferase, FLuc）作為實驗報告基因，用于反映目標(biāo)調(diào)控元件的活性水平；以海腎熒光素酶（Renilla Luciferase, RLuc）作為內(nèi)參報告基因，可有效校正轉(zhuǎn)染效率、生理狀態(tài)等無關(guān)干擾因素，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。與傳統(tǒng)單熒光素酶檢測技術(shù)相比，Dual-LUC技術(shù)無需額外設(shè)置空白對照，操作簡便且靈敏度較高，同時可有效規(guī)避化合物自發(fā)熒光帶來的干擾，是分子機(jī)制研究中認(rèn)可度較高的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究。

該技術(shù)無需進(jìn)行電泳、雜交等復(fù)雜操作，通過檢測熒光素酶催化底物產(chǎn)生的熒光信號，可精準(zhǔn)量化調(diào)控活性，實驗效率高、結(jié)果穩(wěn)定性強(qiáng)。

實驗流程

1. 載體構(gòu)建

2. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 GV3101感受態(tài)細(xì)胞

（1）取-80℃保存的農(nóng)桿菌待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時插入冰中；

（2）每100 μL感受態(tài)加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA，依次于冰上靜置5?min、液氮5?min、37?℃水浴5?min、冰浴5?min；

（3）加入700?μL液體LB ，28℃振蕩培養(yǎng)2-3?h；

（4）6000 rpm 1min收集菌，留100?μL涂布于相應(yīng)抗生素的LB平板上，28℃培養(yǎng)2-3天。

3. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時表達(dá)

（1）挑單克隆于5 mL LB 液體中，分別加50 μg/mL載體和農(nóng)桿對應(yīng)抗生素；28-30℃震蕩培養(yǎng)；

（2）1 mL過夜培養(yǎng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)到25 mL LB液體培養(yǎng)基中（加對應(yīng)抗生素）；

（3）4000 rpm 離心 10 min 收集菌體，棄上清；加入 1 mL 10 mM MgCl2重懸菌體，4000 rpm 離心10 min，棄上清；重復(fù)上述步驟3次；

（4）用浸潤緩沖液定容至OD600?= 1.2，按照不同組合，28℃黑暗培養(yǎng)2-3 h，按實驗組別將菌液等體積混合；

（5）選長勢良好的本氏煙，由上至下第3-?6片完全展開的真葉滲透接種農(nóng)桿菌；

（6）將農(nóng)桿菌注射到煙草葉片中，做好標(biāo)記；注射過后的植株培養(yǎng)36-48 h。

4. 煙草葉片熒光檢測

4.1 定性觀察

（1）通過Tanon活體成像系統(tǒng)分析待檢測樣品間的互作；

（2）用熒光素底物D-熒光素鉀鹽的反應(yīng)液噴濕葉片背面，黑暗處理7 min；

（3）將葉片置于Tanon活體成像儀中檢測發(fā)光情況。

4.2 定量檢測

（1）通過Opticsmate U6多功能酶標(biāo)儀定量分析待檢測樣品間的互作強(qiáng)度；

（2）通過打孔器取樣于2 mL離心管中，液氮冷凍后研磨；

（3）研磨后加100 μ?L裂解液，混勻后冰上放置5 min；

（4）13000 rpm 1 min，取20 μL 上清置于96孔酶標(biāo)板中，設(shè)置 6 孔重復(fù)；

（5）根據(jù)試劑盒進(jìn)行相關(guān)操作并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；

一、轉(zhuǎn)錄因子-靶基因啟動子

轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子的特異性結(jié)合，是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的核心環(huán)節(jié)，Dual-LUC技術(shù)是驗證二者互作關(guān)系的經(jīng)典實驗方法，具有特異性高、結(jié)果可靠等優(yōu)勢。

??核心原理：將靶基因啟動子序列克隆至螢火蟲熒光素酶基因（FLuc）上游，構(gòu)建靶基因啟動子-Fluc重組報告載體；同時構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)或沉默載體，共轉(zhuǎn)染至目標(biāo)細(xì)胞。若轉(zhuǎn)錄因子可與靶基因啟動子發(fā)生特異性結(jié)合，則會激活Fluc的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使螢火蟲熒光強(qiáng)度顯著升高；若對啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進(jìn)行突變，熒光強(qiáng)度會出現(xiàn)明顯下降，據(jù)此可直接證實轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的互作關(guān)系。

二、miRNA與靶基因

miRNA（microRNA）是一類長度約21–23?bp的內(nèi)源性非編碼RNA，被譽(yù)為基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控開關(guān)。在分子機(jī)制研究中，miRNA既是解析信號通路、解析疾病發(fā)生機(jī)理的關(guān)鍵分子，也是篩選分子標(biāo)志物、開發(fā)靶向干預(yù)策略的重要靶點，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、發(fā)育時序與應(yīng)激響應(yīng)等核心生命過程。

? 核心原理：miRNA通過與靶基因mRNA的3’-UTR互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制翻譯或促進(jìn)mRN降解，從而抑制熒光素酶的翻譯使熒光值降低。

三、轉(zhuǎn)錄因子活性鑒定

轉(zhuǎn)錄因子是基因表達(dá)的核心調(diào)控蛋白，其活性決定基因是否表達(dá)、表達(dá)強(qiáng)弱，進(jìn)而控制細(xì)胞命運、生理狀態(tài)、疾病發(fā)生，是生命調(diào)控的關(guān)鍵節(jié)點。

? 核心原理：將待測轉(zhuǎn)錄因子與GAL4結(jié)合域構(gòu)建在同一載體上，與含有GAL-TATA轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件并帶有熒光蟲熒光素酶(FLuc)的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)，使這段序列調(diào)控Luciferase的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。通過檢測熒光值的高低可以判斷轉(zhuǎn)錄因子是否具有轉(zhuǎn)錄激活或者轉(zhuǎn)錄抑制作用。

四、啟動子活性鑒定

啟動子是位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）上游的一段順式作用DNA調(diào)控元件，通常長度在幾百至數(shù)千bp，不編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列，而是通過提供RNA聚合酶、通用轉(zhuǎn)錄因子及特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合位點，精確控制基因的轉(zhuǎn)錄起始效率、組織特異性、發(fā)育時序性與環(huán)境響應(yīng)性。

? 核心原理：將待測啟動子構(gòu)建至熒光素酶基因的上游，以螢火蟲熒光素酶（FLuc）反映待測啟動子的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度。

技術(shù)優(yōu)勢

體內(nèi)實驗：內(nèi)源性表達(dá)，更真實的展示體內(nèi)的互作情況

高靈敏度：不受細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)的影響

高準(zhǔn)確性：植物、哺乳動物中無報告基因內(nèi)源性表達(dá)

常見問題及解答

1. 熒光值過高或過低怎么辦

熒光值一般讀數(shù)在5-6位之間較好，若熒光值過高或過低可嘗試從以下方式解決：

（1）熒光值過高：

a、減少質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量；

b、細(xì)胞樣品裂解后，離心取上清后檢測或?qū)α呀猱a(chǎn)物進(jìn)行稀釋后檢測。

（2）熒光值過低：

a、轉(zhuǎn)染效率低：優(yōu)化轉(zhuǎn)染實驗條件，確保轉(zhuǎn)染DNA的質(zhì)量；

b、樣品裂解效率低：細(xì)胞培養(yǎng)時間不宜過長，長時間培養(yǎng)后，細(xì)胞可能會難裂解；加入的裂解液需足量，裂解時間控制在24-48小時，保證細(xì)胞能夠充分裂解。

c、檢測過程操作不規(guī)范：應(yīng)室溫條件下反應(yīng)，即各個組分包括細(xì)胞裂解液、底物工作液都需要調(diào)整至室溫

d、底物氧化失敗：底物避光密封保存，螢火蟲熒光素酶底物-20℃保存；海腎熒光素酶底物推薦-80℃保存；反應(yīng)工作液建議現(xiàn)用現(xiàn)配。

2. 復(fù)孔重復(fù)性差

報告基因檢測靈敏度高，影響因素多。除了引入另一個報告基因作為內(nèi)參照避免實驗條件變化的干擾之外，一般還需設(shè)置3個或3個以上復(fù)孔，應(yīng)盡可能減小復(fù)孔之間的差異性，復(fù)孔之間的數(shù)值有一定差異是正常的，一般認(rèn)為在同一個數(shù)量級的差異是可以接受的。

a、細(xì)胞裂解后建議離心取上清，保證樣本的均一性；

b. 保證加樣的準(zhǔn)確性，移液器需定期校準(zhǔn)，確保移液精準(zhǔn)；

3. 螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的區(qū)別

螢火蟲熒光素酶在氧氣、ATP和鎂離子同時存在的條件下，催化熒光素氧化，生成氧化熒光素，同時產(chǎn)生黃綠色光，波長540-600nm，一般檢測時選用560nm。海腎熒光素酶只需要氧氣就可以催化腔腸素氧化產(chǎn)生藍(lán)光，波長460-540nm，一般檢測時選用460nm。