雙熒光素酶報(bào)告基因
雙熒光素酶報(bào)告基因是以螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）為報(bào)告基因，以海腎熒光素酶（Renilla luciferase）為內(nèi)參基因，通過同時(shí)檢測(cè)兩種熒光素酶，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)或分子互作的定量分析。
檢測(cè)原理
將研究的調(diào)控元件（如啟動(dòng)子、miRNA靶序列等）插入帶有螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)的表達(dá)載體，構(gòu)建成報(bào)告基因質(zhì)粒，使這段序列調(diào)控螢火蟲熒光素酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。然后將報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并加入底物熒光素(luciferin)，由于螢火蟲熒光素酶可催化熒光素發(fā)出熒光(最強(qiáng)波長(zhǎng)在560 nm左右)，通過檢測(cè)得到的熒光值高低，即可判斷不同處理組下熒光素酶的活性，進(jìn)而定量分析目標(biāo)基因表達(dá)或分子互作。
同時(shí)將海腎熒光素酶基因作為內(nèi)參使用，將兩個(gè)報(bào)告基因構(gòu)建到同一個(gè)質(zhì)粒上，分別用不同的啟動(dòng)子啟動(dòng)其表達(dá)，消除細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。
圖1：雙熒光素酶報(bào)告基因原理
主要應(yīng)用
1、驗(yàn)證miRNA與靶基因的作用
miRNA可以通過基因剪切或翻譯抑制等方式來調(diào)控靶基因，精準(zhǔn)控制其表達(dá)水平。通過將待測(cè)靶基因序列（3’UTR）插入LUC的報(bào)告基因載體，當(dāng)miRNA能夠和靶基因作用時(shí)，miRNA會(huì)通過和所插入的序列結(jié)合從而抑制熒光素酶的翻譯使熒光值降低。
圖2：驗(yàn)證miRNA與靶基因的作用
2、研究miRNA和lncRNA/circRNA的靶向互作
許多l(xiāng)ncRNA具有與mRNA相似的結(jié)構(gòu)，miRNA可通過與作用于mRNA類似的機(jī)制對(duì)lncRNA起負(fù)調(diào)控作用。將候選的lncRNA序列插入報(bào)告基因載體上，當(dāng)miRNA能夠和Inc/circRNA作用時(shí)，miRNA會(huì)通過和所插入的序列結(jié)合從而抑制熒光素酶的翻譯使熒光值降低。
圖3：研究miRNA和lncRNA/circRNA的靶向互作
3、研究轉(zhuǎn)錄因子對(duì)下游基因的作用
轉(zhuǎn)錄因子與其靶啟動(dòng)子中的特異序列（順式作用元件）結(jié)合，從而對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。通過將啟動(dòng)子區(qū)域序列插入LUC的報(bào)告基因載體，同時(shí)共轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子能與對(duì)應(yīng)啟動(dòng)子結(jié)合，則可以轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生熒光素酶提升熒光值。
圖4：研究轉(zhuǎn)錄因子對(duì)下游基因的作用
4、啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析
將啟動(dòng)子區(qū)域序列進(jìn)行分段截短，或?qū)μ囟ㄎ稽c(diǎn)進(jìn)行突變，再分別構(gòu)建入熒光素酶報(bào)告載體，檢測(cè)其啟動(dòng)子活性。
圖5：?jiǎn)?dòng)子結(jié)構(gòu)分析
5、啟動(dòng)子SNP分析
一些基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在單核苷酸多態(tài)性，可運(yùn)用螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析其相對(duì)活性。
圖6：?jiǎn)?dòng)子SNP分析
6、驗(yàn)證啟動(dòng)子活性
將待測(cè)啟動(dòng)子構(gòu)建至熒光素酶基因的上游，檢測(cè)啟動(dòng)子的活性。
圖7：驗(yàn)證啟動(dòng)子活性
7、驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子活性
將待測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與GAL4結(jié)合域構(gòu)建在同一載體上，與含有GAL-TATA轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件并帶有熒光蟲熒光素酶(Firefly luciferase)的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)，使這段序列調(diào)控luciferase的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。通過檢測(cè)熒光值的高低可以判斷轉(zhuǎn)錄因子是否具有轉(zhuǎn)錄激活或者轉(zhuǎn)錄抑制作用。
圖8：驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子活性
產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)
樣品要求
服務(wù)內(nèi)容
案例展示
2021 年 10 月 7發(fā)表于New Phytologist
?( IF=8.3 )上一篇題為ZmMPK5 phosphorylates ZmNAC49 to enhance oxidative stress tolerance in maize的研究型論文種，作者將ZmSODs（ZmSOD1、ZmSOD2、ZmSOD3、ZmSOD4）的啟動(dòng)子序列克隆至載體p1381-LUC中。效應(yīng)載體使用玉米泛素啟動(dòng)子（Ubi）驅(qū)動(dòng)ZmNAC49表達(dá)（Ubi:ZmNAC49），以空載體作為對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZmNAC49激活了ZmSOD3啟動(dòng)子的LUC表達(dá)，表明ZmSOD3是ZmNAC49 的靶基因。
圖9：ZmSODs與ZmNAC49互作研究
2020年發(fā)表于Molecular Plant（IF=?17.1）上一篇題為“Novel miR167a-OsARF6-OsAUX3?Module Regulates Grain Length and Weight in Rice”的研究型論文，作者通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)OsARF6的編碼區(qū)存在miR167a互補(bǔ)序列。于是作者將OsARF6的野生型3'UTR（含miR167a結(jié)合位點(diǎn)）克隆至熒光素酶報(bào)告載體，構(gòu)建pGREEN-OsARF6:LUC。
同時(shí)將同義突變破壞miR167a結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建突變型報(bào)告載體pGREEN-mOsARF6:LUC。然后作者將miR167a前體與野生型/突變型報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染水稻原生質(zhì)體。設(shè)置四組比較：空載體 ± miR167a前體（基線對(duì)照）；野生型OsARF6:LUC ± miR167a前體；突變型mOsARF6:LUC ±?miR167a前體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型組miR167a前體使熒光素酶活性顯著降低而突變型組miR167a前體無法抑制熒光素酶活性，于是作者得出結(jié)論OsARF6與miR167a存在互作，且該互作為特異性的。
圖10：OsARF6與miR167a的互作研究
