這篇文章于2023年5月以封面文章的形式發(fā)表于The Journal of Clinical Investigation（IF=15.9，Targeting hypoxia-inducible factors with 32-134D safely and effectively treats diabetic eye disease in mice），是一篇探討新治療靶點(diǎn)對存在治療難題疾病治療效果提升的文章，主要是對新靶點(diǎn)的驗(yàn)證思路以及后續(xù)的靶向新靶點(diǎn)藥物的篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)比較有意思，相關(guān)同學(xué)可以借鑒一下。
研究意義：糖尿病視網(wǎng)膜病變（Diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，是糖尿病導(dǎo)致的視網(wǎng)膜微血管滲漏和阻塞從而引起一系列的眼底病變，如微血管瘤、硬性滲出、棉絮斑、新生血管、玻璃體增殖、黃斑水腫甚至視網(wǎng)膜脫離。DR以是否有從視網(wǎng)膜發(fā)出的異常新生血管作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，可分為增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變（Proliferative diabetic retinopathy，NPDR）和非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變（Nonproliferative diabetic retinopathy，NPDR）（圖1）。晚期糖基化終末產(chǎn)物、氧化應(yīng)激和炎癥等均可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)血管損傷→缺血和促血管生成因子表達(dá)增加→血管新生→NPDR進(jìn)展為PDR。糖尿病性黃斑水腫（Diabetic macular edema，DME）是糖尿病視網(wǎng)膜病變的另一重要改變，沒有視網(wǎng)膜缺血時(shí)也可發(fā)生。值得注意的是，臨床50%以上的PDR和DME患者對常規(guī)抗VEGF療法應(yīng)答不理想，亟需找到新治療靶點(diǎn)和藥物。低氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia-inducible factors，HIFs）是調(diào)控視網(wǎng)膜血管疾病相關(guān)血管活性調(diào)節(jié)蛋白的重要轉(zhuǎn)錄因子，且HIF1α和HIF2α在缺血性視網(wǎng)膜疾病里顯著增加【1】。考慮到非缺血情況下也能檢測到VEGF表達(dá)上調(diào)，而HIFs通常在缺氧條件下才會發(fā)生蛋白積聚并發(fā)揮功能，因此有研究認(rèn)為DME患者VEGF表達(dá)增加與HIFs無關(guān)。但最近有研究指出，許多糖尿病眼病相關(guān)的炎癥因子和生長因子可以通過非缺氧依賴的方式增強(qiáng)HIFs活性（即HIFs表達(dá)增加存在非經(jīng)典調(diào)控通路）。所以，HIFs的非經(jīng)典調(diào)控能否影響NPDR/DME呢？結(jié)合“HIFs可以促進(jìn)缺血視網(wǎng)膜組織VEGF、VEGFR2、EPO、PDGFB、ANGPTL4、MMPs和PAI-1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但對生理狀態(tài)下上述基因的表達(dá)沒有顯著影響“這一現(xiàn)象，因此HIFs有可能成為糖尿病視網(wǎng)膜病變治療的新靶點(diǎn)。
研究策略： 本篇文章主要聚焦于糖尿病視網(wǎng)膜病變，探究了HIFs轉(zhuǎn)錄因子作為其主要病理改變NPDR和PDR的新治療靶點(diǎn)，以及靶向HIFs的多個(gè)抑制劑對它們的治療作用。主要根據(jù)“臨床已有治療方法效果不理想，需要新的治療靶點(diǎn)和藥物→HIFs有可能作為其新治療靶點(diǎn)→體內(nèi)體外利用其抑制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證→確定其可以作為糖尿病視網(wǎng)膜病變的新治療靶點(diǎn)，并確定其抑制劑可以作為潛在治療藥物“這一邏輯鏈進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。比較幸運(yùn)的是，他們發(fā)現(xiàn)HIFs是可以作為新治療靶點(diǎn)的，且通過藥物篩選和實(shí)驗(yàn)，他們排除了已有的兩個(gè)HIFs抑制劑作為新治療藥物的可能，并找到了一個(gè)更加安全且特異性更高的HIFs抑制劑32-134D，因此具有較大的臨床意義。
研究方法：
1、抗VEGF治療不影響PDR患者晶狀體HIFs調(diào)控的血管活性調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，但抑制HIFs可以抑制其表達(dá)和血管新生
? ? ? 作者先檢測了PDR患者眼部組織HIF依賴的血管活性調(diào)節(jié)蛋白在抗VEGF療法治療中的表達(dá)改變。PDR患者由于持續(xù)的高血糖狀態(tài)會導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管損傷，進(jìn)而引起缺氧和血管新生（圖2A）。雖然PDR患者VEGF以及其它HIF依賴的血管活性調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)均顯著增加（ANGPTL4、ANGPT2、EPO和MMP-2）,但這些調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)不受抗VEGF治療的影響（圖2B-C）。作者還利用低氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型小鼠探究了HIFs對視網(wǎng)膜血管新生的影響。結(jié)果顯示，HIFs抑制劑地高辛顯著抑制HIF依賴的血管活性調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)以及小鼠的血管新生（圖2D-E）。因此，HIFs是治療PDR的潛在靶點(diǎn)。
2、抗VEGF治療不影響DME患者眼房組織HIFs調(diào)控的血管活性調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，但抑制HIFs可以抑制其表達(dá)并降低血管通透性
? ? ? 接下來，作者檢測了抗VEGF療法對DME患者眼部組織HIF依賴的血管活性調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的影響。NPDR患者由于視網(wǎng)膜血管損傷，會導(dǎo)致微血管瘤的發(fā)生和血管通透性增加，最終導(dǎo)致DME（圖3A）。檢測NPDR/DME患者的眼房組織發(fā)現(xiàn)，HIF依賴的血管活性調(diào)節(jié)蛋白ANGPTL4和ANGPT2表達(dá)顯著增加，而抗VEGF療法對二者表達(dá)沒有顯著影響（圖3B）。接下來，作者用STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠模擬DME并檢測HIFs對其進(jìn)展的影響。與DME患者類似，STZ小鼠視網(wǎng)膜組織不存在缺氧的情況，但STZ小鼠病變視網(wǎng)膜組織HIF1α和HIF2α水平顯著增加，表明糖尿病視網(wǎng)膜病變HIFs受非經(jīng)典通路調(diào)控（圖3C-D）。相應(yīng)的，受HIF轉(zhuǎn)錄調(diào)控的血管活性調(diào)節(jié)蛋白VEGF和ANGPTL4表達(dá)增加（圖3E）。用地高辛抑制HIFs可顯著抑制VEGF和ANGPTL4表達(dá)，降低血管通透性（圖3F-G）。因此，HIFs是治療NPDR/DME的新靶點(diǎn)。
3、HIF抑制劑Acriflavine只能以脫靶的方式抑制視網(wǎng)膜病變
? ? ? 由于地高辛藥代動力學(xué)復(fù)雜且可用治療范圍有限，因此，難以將其作為糖尿病視網(wǎng)膜病變治療的潛在藥物，所以作者接下來評估了另一靶向HIFs的抑制劑acriflavine在糖尿病視網(wǎng)膜病變里的治療作用。STZ糖尿病小鼠在注射了acriflavine后視網(wǎng)膜血管滲透性顯著下降，且單次注射的緩解效果可維持3個(gè)月（圖4A-B）。但視網(wǎng)膜電圖（Electroretinogram，ERG）的結(jié)果表明，較高劑量的acriflavine會顯著影響視網(wǎng)膜功能，即有毒性（圖4C）。檢測處理過STZ小鼠的視網(wǎng)膜，發(fā)現(xiàn)其神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層（GCL）顯著變薄，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）顯著減少，但低氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變Hif1a+/–和Hif2a+/–模型小鼠RGCs卻沒有顯著改變，提示acriflavine對視網(wǎng)膜細(xì)胞作用是藥物脫靶導(dǎo)致的（圖4D-F）。因此，acriflavine的長期較高劑量使用會破壞視網(wǎng)膜，且其對糖尿病視網(wǎng)膜病變的緩解作用是藥物脫靶所致。
4、HIF的新抑制劑32-134D通過促進(jìn)HIF1α和HIF2α蛋白酶體降解抑制HIFs調(diào)控的血管活性調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)
? ? ? 由于HIFs抑制劑地高辛和acriflavine無法作為糖尿病視網(wǎng)膜病變的備選藥，作者嘗試檢測另一個(gè)新近報(bào)道的HIFs抑制劑32-134D對糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療作用【2】。32-134D顯著抑制低氧條件下視網(wǎng)膜細(xì)胞HIF1α和HIF2α的蛋白聚集（圖5A）。接下來，作者檢測了蛋白酶體和溶酶體這兩條蛋白降解主要途徑在32-134D促進(jìn)HIFs降解過程里的作用。抑制溶酶體途徑對該過程沒有顯著影響，但抑制蛋白酶體途徑能顯著緩解其促降解作用（圖5B-C）。因此，32-134D通過促進(jìn)蛋白酶體途徑抑制HIF1α和HIF2α蛋白的聚集，從而抑制HIFs相關(guān)信號通路。對依賴HIF的血管活性調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的檢測顯示，32-134D顯著抑制缺氧引起的促血管新生基因表達(dá)上調(diào)（圖5D）。由于血管內(nèi)皮細(xì)胞也分泌促血管新生因子以促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)展，作者檢測了32-134D對原代內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs的HIFs蛋白表達(dá)和促血管新生基因表達(dá)的影響，結(jié)果與視網(wǎng)膜細(xì)胞相同（圖5E-F）。此外，作者還利用人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞構(gòu)建的視網(wǎng)膜類器官（含有幾乎所有的視網(wǎng)膜細(xì)胞特異性細(xì)胞）對32-134D的作用進(jìn)行了檢測，結(jié)果同上（圖5G-H）。因此，32-134D通過促進(jìn)HIFs的蛋白酶體降解抑制其功能。
5、32-134D抑制視網(wǎng)膜病變模型小鼠HIFs蛋白和下游基因表達(dá)，緩解視網(wǎng)膜病變，且沒有顯著毒性
? ? ? 接下來作者在小鼠體內(nèi)水平驗(yàn)證了32-134D對視網(wǎng)膜病變和HIFs通路的影響。腹腔給予視網(wǎng)膜病變模型小鼠32-134D顯著抑制HIF1α和HIF2α蛋白聚集，以及受其調(diào)控的血管活性調(diào)節(jié)因子表達(dá)和血管新生（圖6A-C）。為避免全身給藥可能帶來的毒性作用，作者還評估了眼球局部給藥對小鼠視網(wǎng)膜正常結(jié)構(gòu)和功能的影響。結(jié)果顯示，局部給藥對視網(wǎng)膜正常功能和結(jié)構(gòu)沒有顯著影響（圖6D-E）。因此， 32-134D可能成為治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的新藥物，且沒有明顯的毒副作用。
6、眼部注射32-134D逆轉(zhuǎn)缺氧對視網(wǎng)膜組織轉(zhuǎn)錄組的改變并改善視網(wǎng)膜病變
? ? ? 優(yōu)化了32-134D眼部給藥的藥物動力學(xué)之后（原文有詳盡的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，做新藥體內(nèi)實(shí)驗(yàn)藥代的同學(xué)可以參考），作者進(jìn)一步探究了眼部給藥對視網(wǎng)膜組織病理改變以及分子層面改變的影響。RNA-seq的結(jié)果表明，眼部注射32-134D顯著逆轉(zhuǎn)缺氧對視網(wǎng)膜組織轉(zhuǎn)錄組的改變（圖7A-B），且眼部注射32-134D顯著抑制HIF1α和HIF2α蛋白聚集、促血管新生基因表達(dá)以及血管新生（圖7C-E）。此外，眼部注射32-134D顯著緩解STZ糖尿病小鼠視網(wǎng)膜血管的高滲狀態(tài)（圖7F）。所以，32-134D對糖尿病視網(wǎng)膜病變具有更好的治療效果和適用范圍，可作為臨床治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的備選用藥。
Take-home message：
? ? ? 這篇文章主要聚焦于臨床問題“糖尿病視網(wǎng)膜病變已有治療方法治療效果不理想”，因此作者根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研想探究HIFs這一低氧相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子作為這種疾病治療靶點(diǎn)的可行性?？茖W(xué)問題的提出沒有特別亮眼的地方，主要還是多看文獻(xiàn)、多思考、多做預(yù)實(shí)驗(yàn)（+多祈禱），也沒有太多機(jī)制方面的闡述驗(yàn)證。需要指出的是，作者的研究目的比較明確可能是由于其同事剛在同一期刊發(fā)表了HIFs新抑制劑相關(guān)的文章，同時(shí)結(jié)合自身的文獻(xiàn)調(diào)研，便將HIFs與這個(gè)疾病聯(lián)系到了一起。有了開頭（種子），后面便是利用細(xì)胞和動物模型探究其抑制劑作為治療該疾病新藥物可行性的評估。比較有意思的是，在證實(shí)了已有藥物的缺陷后，作者利用同事在2022年發(fā)現(xiàn)的HIFs抑制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，解決了已有抑制劑安全性和特異性不足的難題，為文章增加了新穎性和實(shí)用性，亦為基礎(chǔ)和臨床相關(guān)問題的解決提供了重要線索，可能這也是這篇文章成為JCI封面文章的原因。
【參考文獻(xiàn)】
1. Paulus, Y. M. et al. Anti-angiogenic Therapy for Retinal Disease. Handb Exp Pharmacol 242, 271, doi:10.1007/164_2016_78 (2017).
2. Salman, S. et al. HIF inhibitor 32-134D eradicates murine hepatocellular carcinoma in combination with anti-PD1 therapy. J Clin Invest 132, doi:10.1172/JCI156774 (2022).
