外泌體即細胞外囊泡（簡稱EVs）是所有細胞主動分泌的納米級囊泡,活細胞釋放不同類型的細胞外囊泡進入細胞外環(huán)境進行細胞間交流,細胞外囊泡越來越多地被認為是有希望的液體活檢生物學標志物?根據(jù)相似囊泡的直徑大小可將細胞外囊泡分為三類,直徑在50-150nm的外泌體,直徑在100-1000nm的微囊泡?外粒體和微顆粒,直徑在-100-5000nm的凋亡小體?目前主要認為,外泌體產(chǎn)生的過程是細胞膜內(nèi)陷形成內(nèi)體,再形成多泡體,多泡體與質(zhì)膜融合導致其管腔內(nèi)囊泡釋放到細胞外,產(chǎn)生一種稱為外泌體的EV亞型?
2 外泌體的提取純化方法
2.1 基于密度的分離方法
2.1.1 超速離心法
超速離心法是最常用的外泌體提取方法,首先,施加較低速度的離心力300g以從細胞培養(yǎng)液中去除細胞;然后,對上清液施加較大的離心力(10000-20000g),去除大的細胞碎片和破碎的細胞器;最后,再次進行高速(100000-150000g)離心從上清液中收集外泌體,所有離心在4℃下進行?超速離心法獲得的外泌體不被分離試劑污染,且分離數(shù)量多,處理樣本小?盡管超速離心法是提取外泌體最廣泛的“金標準”,但仍然有很多缺點,如所需的超高速離心儀器比較昂貴?樣品量大?耗時長?電鏡觀察外泌體時仍存在蛋白質(zhì)污染?
2.1.2 蔗糖密度梯度離心法
目前已發(fā)現(xiàn),外泌體在蔗糖梯度為1.15-1.19g/mL密度中漂浮,所以根據(jù)這個特性,可以將樣品與蔗糖梯度溶液一起超速離心,外泌體沉降到不同的密度區(qū)域就可以將其區(qū)分出來?蔗糖密度梯度離心法需要預先配好連續(xù)梯度濃度的蔗糖溶液,將蔗糖溶液鋪于離心管底部,再將樣本放于上部,4℃下100000g超速離心?蔗糖密度梯度離心法獲得的外泌體純度較高,但是前期準備復雜,耗時長,又不能完全將外泌體與蛋白質(zhì)分離開?2013年10月ISEV會議一些研究人員表示,通過蔗糖密度梯度離心法分離囊泡時,細胞囊泡的生物功能喪失?
2.2 沉淀法
2.2.1?聚乙二醇(PEG)
PEG是一種水溶性非離子化合物,具有極強的親水性,可以與疏水的脂質(zhì)雙分子層結合,從而改變外泌體的溶解度而使外泌體沉淀?RIDER等研究發(fā)現(xiàn),PEG水平會影響外泌體的產(chǎn)率,且從外泌體中獲得的總蛋白和RNA在數(shù)量和質(zhì)量上足以用于蛋白質(zhì)組學和測序分析?沉淀法操作簡單,不需要特殊設備,更經(jīng)濟,外泌體產(chǎn)量高,但是會沉淀一些非外泌體的疏水性物質(zhì)而導致外泌體純度不夠?
2.2.2 試劑盒法
最近已經(jīng)開發(fā)出基于聚合物共沉淀的試劑盒,如ExoQuick?TEI等,可用于提取多種體液中的外泌體?聚合物沉淀劑ExoQuick與樣品4℃共孵育30min,然后室溫1500g離心30min,即可獲得外泌體沉淀?與超速離心法比較,試劑盒法更簡便?耗時短,且能獲得更高的外泌體產(chǎn)量?試劑盒法獲得外泌體沉淀含有的雜質(zhì)較多,不同來源的樣本需要使用不同的試劑盒來進行提取,且試劑盒價格較貴?
2.3 基于大小的分離方法
2.3.1 SECSEC
主要根據(jù)外泌體的大小對外泌體進行分離和純化?樣品中大分子物質(zhì)不能進入凝膠孔而被流動相快速洗脫出來,尺寸小于孔徑的物質(zhì)可進入多孔材料,需要較長時間被洗脫出來,即可通過不同的洗脫時間分離外泌體?BING等證明了瓊脂糖凝膠可以從無血小板上清液中純化出外泌體,通過這種方法,外泌體很容易從蛋白質(zhì)和高密度脂蛋白中分離出來?HONG等通過改編和使用mini-SEC方法能夠有效分離出外泌體,與漫長而復雜的超速離心法不同,它可在30min內(nèi)完成外泌體分離?通過SEC分離的外泌體純度較高,分離出結構上完整且功能活躍的囊泡是基于微型SEC分離的重要優(yōu)勢,但數(shù)量較少,而且需要特殊設備,故應用不廣泛?
2.3.2超濾法
超濾法是根據(jù)外泌體的大小使用相應孔徑的濾膜,將樣品中小分子物質(zhì)過濾到膜的另一側(cè),而將大分子物質(zhì)滯留在膜上來達到分離的目的?超慮法簡單?省時?成本低?LIU等改良了簡單的超濾法,通過將不同孔徑的膜(200?100?80?50?30nm)串聯(lián)在一起,實現(xiàn)了不同大小外泌體的快速分離,且捕獲效率明顯高于超速離心法?然而,過濾器很容易被囊泡和其他大分子物質(zhì)堵塞,這種情況很容易導致膜壓力過大而破碎?
2.4 基于表面成分親和力的分離法
2.4.1 蛋白質(zhì)
外泌體表面含有豐富的蛋白質(zhì),所以基于其表面成分的親和力特別適合于分離外泌體?CD63是外泌體中發(fā)現(xiàn)的最豐富的蛋白質(zhì)之一,因此,常用抗CD63免疫吸附外泌體?ZHAO等通過使用抗CD63包裹的磁珠與血液樣品不斷混合,將外泌體捕獲到磁珠上后,加緩沖液沖洗5min,然后引入3種不同熒光染料標記的抗體[抗CD24?抗上皮細胞黏附分子(抗EpCAM)?抗糖類抗原-125(抗CA-125)],通過觀察不同熒光強度可以量化卵巢癌中不同腫瘤標志物的表達水平?
2.4.2 膜磷脂
雖然大部分基于表面成分的親和方法是基于外泌體表面的蛋白質(zhì),但是脂質(zhì)雙層也是一種很好的檢測目標?XU等利用外泌體膜上表達的磷脂酰絲氨酸(PS)可以被PS結合受體Tim4很好地結合,用Tim4固定化的磁珠與樣品反應進行外泌體捕獲,并且觀察到洗脫的外泌體保持著完整的形態(tài),與商業(yè)外泌體提取試劑盒相比,表現(xiàn)出更高的捕獲率?CHEN等利用外泌體將帶負電荷的PS暴露在膜上的特點,使用帶正電荷基團的離子交換樹脂的磁珠與血漿樣品反應,血漿中的外泌體就能與磁珠結合,通過這種方法分離的外泌體具有比超速離心法更高的回收率和更少的雜質(zhì)蛋白?
2.5?ACE分離法
ACE微陣列產(chǎn)生的介電泳(DEP)分離力是通過施加交流電場產(chǎn)生的,納米級的粒子和其他納米級實體物質(zhì)被吸引到圓形微電極邊緣周圍的DEP高場區(qū)域,細胞和大的實體物質(zhì)被吸引到DEP低場區(qū)域?IBSEN等的ACE裝置需要30-50μL血漿樣品就能夠在15min內(nèi)將外泌體濃縮到微電極周圍的高場區(qū)域?ACE設備流程明顯快于目前使用的方法,這個裝置簡化了外泌體提取和回收過程的能力,明顯減少了加工步驟和消耗時間?CHEN等構建了具有交叉電極的DEP芯片,能在30min內(nèi)從血漿樣品中分離出外泌體?經(jīng)過測試證明,DEP芯片具有高捕獲率和高回收率,需要的時間更短,并且不需要笨重和貴重的儀器?
2.6 微流控芯片法
微流控芯片法是新開發(fā)出來的用于快速高效分離樣品中外泌體的方法?WOO等使用2個納米過濾器(Exodisc)集成的實驗盤在30min內(nèi)實現(xiàn)了20-600nm外泌體的全自動富集?使用納米粒子跟蹤分析定量檢測證實了細胞培養(yǎng)上清液中外泌體的回收率大于95%?與超速離心法相比,Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平,更省時,所需樣本量更少?FANG等開發(fā)了一種微流體芯片,將包裹了抗CD63的磁珠與血漿樣品通入芯片,在第1個腔室中捕獲到外泌體,通入一抗與磁珠-外泌體混合物結合,再通入熒光標記的二抗形成磁珠-外泌體-一抗-二抗混合物聚集在第2個腔室?微流控芯片法操作簡單,捕獲率高,特別適合于生物學研究?外泌體作為癌癥診斷的有前景的生物學標志物,其在癌癥的液體活檢中受到關注?外泌體的生物學價值和臨床應用價值凸顯了開發(fā)有效提取和分離外泌體技術的重要性和必要性?相信隨著技術的不斷進步和創(chuàng)新,外泌體提取將變得更加簡便經(jīng)濟,純度越來越高,完整性越來越好?
提取后往往需要進一步檢測，確定提取的是不是外泌體。有三種方法：1. 掃描電鏡觀察；2. NTA儀器粒徑檢測；3. WB檢測。如圖所示，在外泌體上往往存在許多標志物，這時候就可以選擇相應的抗體進行WB檢測。根據(jù)22 篇外泌體相關文獻的統(tǒng)計，排在前4 位的檢測指標為?CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、CD9 和CD81并列第三位（6/22）；接著檢測較多的4 個指標為Alix （4/22）、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外還有一些指標僅在1 篇文獻中出現(xiàn)過，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。針對外泌體的定性檢測至少選擇兩個指標就能滿足文章發(fā)表需要了，比如檢測CD63 和Tsg101。?
