引言
本系列講解 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué) (Spatial Transcriptomics) 相關(guān)基礎(chǔ)知識(shí)與數(shù)據(jù)分析教程，持續(xù)更新，歡迎關(guān)注，轉(zhuǎn)發(fā)，文末有交流群！
背景
基于測(cè)序的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）平臺(tái)通過使用下一代測(cè)序（NGS）技術(shù)，結(jié)合空間條形碼，在組織的不同空間位置上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定量分析。在平臺(tái)制造和樣本制備過程中，空間位置信息被編碼，并與測(cè)序過程中檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本相關(guān)聯(lián)。這種關(guān)聯(lián)體現(xiàn)在NGS平臺(tái)測(cè)序生成的序列讀取結(jié)構(gòu)中。
為了進(jìn)行空間數(shù)據(jù)分析，需要將原始測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過一系列預(yù)處理步驟，轉(zhuǎn)化為有用的數(shù)據(jù)格式，通常是計(jì)數(shù)矩陣。通過計(jì)數(shù)矩陣，我們可以分析目標(biāo)組織中的基因表達(dá)情況。這些預(yù)處理步驟因平臺(tái)而異，但基本流程是從一系列“讀取序列”開始，最終生成適用于下游分析工具（如Squidpy、Seurat或基于SpatialExperiment對(duì)象的Bioconductor工作流程）的空間數(shù)據(jù)格式。
序列和測(cè)序
在轉(zhuǎn)錄組學(xué)中，“讀取序列”是指從RNA分子逆轉(zhuǎn)錄而來的cDNA片段的核苷酸序列。這些轉(zhuǎn)錄本的豐度反映了基因表達(dá)水平，而這正是轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的核心目標(biāo)。空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的優(yōu)勢(shì)在于能夠?qū)⒆x取序列與RNA分子的起源位置相關(guān)聯(lián)，從而揭示基因表達(dá)的空間分布。生成讀取序列的過程通常包括以下幾個(gè)步驟：
- RNA提取
- 逆轉(zhuǎn)錄
- cDNA片段化
- 接頭連接
- PCR擴(kuò)增
由于PCR擴(kuò)增步驟的存在以及RNA提取過程中的不完美性，讀取序列的豐度只能作為基因表達(dá)的相對(duì)指標(biāo)，而不能作為絕對(duì)值。因此，在進(jìn)行差異表達(dá)分析等下游分析之前，需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。在歸一化之前，讀取序列需要經(jīng)過一系列預(yù)處理步驟，構(gòu)建計(jì)數(shù)矩陣或其他等效數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，以便用于后續(xù)分析。
序列結(jié)構(gòu)
在大多數(shù)基于測(cè)序的空間技術(shù)中，讀取序列通常以“配對(duì)末端”的形式記錄，即DNA片段的兩端分別被測(cè)序，并分別存儲(chǔ)在不同的文件中，通常是.fastq格式的文件。其中一個(gè)文件（通常是讀取1）包含條形碼序列，而根據(jù)是否事先對(duì)讀取序列進(jìn)行了修剪，它還可能包含連接序列或其他結(jié)構(gòu)序列。另一個(gè)文件則包含我們需要與參考基因組或轉(zhuǎn)錄組（或探針集）進(jìn)行比對(duì)以確定表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄本（或探針）序列。
以下是BGI STOmics Stereo-seq用戶手冊(cè)中提供的一個(gè)讀取序列結(jié)構(gòu)示例：
在這里，我們可以看到讀取1是從序列左端開始的前50bp，而讀取2是從序列右端開始的最后100bp。
讀取1中包含了25bp的坐標(biāo)ID（CID）、一個(gè)15bp的固定連接序列，以及一個(gè)10bp的分子ID（MID）。
讀取2僅包含一個(gè)100bp長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本片段。
另一個(gè)例子來自10X Visium CytAssist試劑盒，用于展示基于探針的文庫的結(jié)構(gòu)：
在.fastq文件中，每個(gè)讀取序列都包含一個(gè)對(duì)應(yīng)的序列標(biāo)題和質(zhì)量評(píng)分。這里提供了一個(gè)示例（同樣來自BGI STOmics Stereo-seq用戶手冊(cè)），用于說明：
兩條讀取序列的第一行是“標(biāo)題”或“名稱”，用于唯一標(biāo)識(shí)每條讀取序列，并可能包含一些額外信息，例如讀取序列來自測(cè)序儀的哪一條泳道。此外，標(biāo)題部分還可以插入工具生成的附加元數(shù)據(jù)，以“注釋”的形式呈現(xiàn)。第二行是測(cè)序轉(zhuǎn)錄本的堿基序列，如前文所述。第三行是一個(gè)間隔行，通常只包含一個(gè)“+”字符，盡管有時(shí)會(huì)在這里重復(fù)標(biāo)題中的讀取序列標(biāo)識(shí)符和注釋。第四行是序列中每個(gè)堿基的讀取質(zhì)量評(píng)分。質(zhì)量評(píng)分的衡量標(biāo)準(zhǔn)會(huì)因測(cè)序儀的版本以及是否使用Q4或Q40文件而有所不同。Q分?jǐn)?shù)是基于p值的對(duì)數(shù)形式，用于衡量對(duì)堿基判定的置信度。p值的確切計(jì)算方法以及讀取序列被判定為不可靠的閾值因平臺(tái)而異，因此如果這些統(tǒng)計(jì)信息對(duì)你的分析很重要，建議仔細(xì)檢查你所使用的工具。
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