最近正式踏入全新賽道，此前一直做科研服務(wù)工作，如今加入mRNA疫苗企業(yè)，一切都要從零開始系統(tǒng)學(xué)習(xí)。我始終相信，最好的學(xué)習(xí)方式就是持續(xù)輸出，因此后續(xù)會(huì)在公眾號(hào)定期更新mRNA疫苗相關(guān)的技術(shù)干貨與學(xué)習(xí)筆記。
嘮一句實(shí)在嗑，盡管mRNA算得上當(dāng)下生物專業(yè)里最前沿、最熱門、最具前景的方向，可實(shí)際收入?yún)s依舊低于深圳市平均工資，也讓我越發(fā)覺得：選對(duì)行業(yè)、選對(duì)專業(yè)，真的太重要了。同樣的能力與付出，在生物行業(yè)能拿到10萬(wàn)，換到其他行業(yè)往往20萬(wàn)都不止；即便生物行業(yè)里極少數(shù)頂尖技術(shù)大佬能做到30萬(wàn)，放在其他行業(yè)，收益早已突破百萬(wàn)。
后續(xù)依舊會(huì)一邊學(xué)習(xí)一邊分享，也和大家一起聊聊生物行業(yè)的真實(shí)現(xiàn)狀與技術(shù)干貨。交流合作可以私信加我微信。

mRNA結(jié)構(gòu)組成及功能

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mRNA如何發(fā)揮疫苗功能

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1. 新抗原：以腫瘤疫苗為例，篩選腫瘤新抗原，根據(jù)新抗原氨基酸序列反向推導(dǎo)、優(yōu)化得到目標(biāo) CDS 對(duì)應(yīng)的 DNA 序列
2. DNA模板制備：化學(xué)法全合成 DNA 片段 → 連接質(zhì)粒并大腸桿菌擴(kuò)增 → 限制性酶切得到線性化 DNA 模板
3. mRNA合成：以線性 DNA 為模板體外轉(zhuǎn)錄 (IVT) 合成 mRNA（m1Ψ-TP 替代 UTP 實(shí)現(xiàn)核苷修飾）→ 酶法加帽 + poly (A) 加尾 → 磁珠純化
4. mRNA-LNP復(fù)合物：可電離陽(yáng)離子脂質(zhì) + 輔助脂質(zhì) + 膽固醇 + PEG 脂質(zhì)組裝 LNP → 微流控技術(shù)包封 mRNA → 形成 mRNA-LNP 復(fù)合物
5. *肌內(nèi)注射：上臂三角肌；主流為液體制劑直接注射，凍干劑型需復(fù)溶后注射
6. 細(xì)胞內(nèi)遞送：mRNA-LNP 經(jīng)胞吞進(jìn)入細(xì)胞 → 內(nèi)體酸性環(huán)境觸發(fā) LNP 電離 → 內(nèi)體逃逸 → mRNA 釋放至細(xì)胞質(zhì)
7. 抗原呈遞：mRNA 翻譯出抗原蛋白 → 被酶切為短肽 → 結(jié)合 MHC I/II 類分子呈遞至細(xì)胞表面
8. 免疫細(xì)胞激活：MHC I - 抗原肽激活CD8? T 細(xì)胞，增殖分化為細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞；MHC II - 抗原肽激活Th 細(xì)胞，進(jìn)而輔助激活 B 細(xì)胞產(chǎn)生抗體
9. 殺傷靶細(xì)胞：細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞直接殺傷腫瘤細(xì)胞，特異性抗體協(xié)同清除靶細(xì)胞
   
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mRNA編碼區(qū)優(yōu)化

3.1 序列優(yōu)化相關(guān)指標(biāo)

指標(biāo)	英文全稱	核心定義	生物學(xué)意義	計(jì)算方法	實(shí)際使用方式
RSCU	Relative Synonymous Codon Usage相對(duì)同義密碼子使用度	某一同義密碼子的實(shí)際觀測(cè)頻率與該氨基酸所有同義密碼子的平均預(yù)期頻率的比值，是衡量密碼子使用偏好性的基礎(chǔ)指標(biāo)	1. 反映某一物種/宿主中同義密碼子的使用偏倚程度，數(shù)值越大表示該密碼子被使用的頻率越高；2. 為CAI、tAI等后續(xù)指標(biāo)提供計(jì)算基礎(chǔ)；3. 篩選宿主高表達(dá)基因偏好的密碼子，規(guī)避稀有密碼子	綜述原文公式：? ：第種氨基酸的第個(gè)密碼子的觀測(cè)數(shù)量；? ：第種氨基酸的同義密碼子總數(shù)；通用規(guī)則：RSCU=1：無(wú)使用偏好；RSCU>1：偏好使用；RSCU<1：非偏好/稀有密碼子	1. 作為密碼子優(yōu)化的基礎(chǔ)分析工具，先通過RSCU分析目標(biāo)宿主（如人、小鼠）高表達(dá)基因的密碼子偏好；2. 優(yōu)化時(shí)優(yōu)先選擇宿主中RSCU值高的密碼子，減少尿苷富集的稀有密碼子，降低mRNA先天免疫原性；3. 為CAI、tAI的計(jì)算提供原始數(shù)據(jù)
CAI	Codon Adaptation Index密碼子適應(yīng)指數(shù)	衡量目標(biāo)基因的密碼子使用模式與宿主高表達(dá)基因的密碼子使用模式的適配程度，取值范圍0~1	1. 核心評(píng)估密碼子優(yōu)化后mRNA的翻譯效率，數(shù)值越接近1，與宿主高表達(dá)基因的密碼子適配性越強(qiáng)，翻譯效率越高；2. 是目前mRNA疫苗密碼子優(yōu)化最常用的核心指標(biāo)	綜述原文公式：? ：目標(biāo)基因第個(gè)密碼子的RSCU值；? ：該密碼子對(duì)應(yīng)氨基酸的最大RSCU值；? ：目標(biāo)基因的密碼子總數(shù)；? ：目標(biāo)基因觀測(cè)CAI值；：理論最大CAI值	1. mRNA疫苗優(yōu)化的核心參考指標(biāo)，如輝瑞B(yǎng)NT162b2、莫德納mRNA-1273的疫苗序列CAI值均被優(yōu)化至0.9以上；2. 單獨(dú)優(yōu)化CAI不足以實(shí)現(xiàn)最優(yōu)蛋白表達(dá)，需與GC含量、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)合；3. 適用于整體編碼區(qū)的翻譯效率評(píng)估，是高通量序列篩選的快速指標(biāo)
tAI	tRNA Adaptation IndextRNA適應(yīng)指數(shù)	從tRNA的可用性/豐度角度，衡量密碼子與宿主tRNA庫(kù)的匹配程度，反映翻譯過程中核糖體的延伸效率	1. 比CAI更貼近實(shí)際翻譯過程，因?yàn)榉g效率不僅取決于密碼子偏好，還受對(duì)應(yīng)tRNA的豐度限制；2. 解釋“翻譯斜坡假說”：基因前30~50個(gè)密碼子的稀有密碼子（低tAI）可減緩翻譯起始，提升蛋白折疊正確性；3. 補(bǔ)充CAI的局限性，更精準(zhǔn)評(píng)估翻譯效率	通用標(biāo)準(zhǔn)方法（綜述原文補(bǔ)充）：1. 先獲取宿主tRNA基因拷貝數(shù)（常用）或tRNA-seq檢測(cè)的實(shí)際豐度，作為tRNA可用性的替代指標(biāo)；2. 引入擺動(dòng)配對(duì)修正系數(shù)（考慮tRNA反密碼子與密碼子的非標(biāo)準(zhǔn)配對(duì)）；3. 計(jì)算每個(gè)密碼子的tAI值，再對(duì)整個(gè)基因的密碼子tAI值取幾何平均，得到基因整體tAI值	1. 與CAI聯(lián)合使用，彌補(bǔ)CAI僅考慮密碼子偏好、忽略tRNA豐度的缺陷；2. 優(yōu)化時(shí)弱化編碼區(qū)前30~50個(gè)密碼子的tAI要求，保留適量稀有密碼子，符合“翻譯斜坡假說”；3. 針對(duì)不同宿主（如人、CHO細(xì)胞）定制化優(yōu)化，需匹配對(duì)應(yīng)宿主的tRNA庫(kù)數(shù)據(jù)；4. 提升tAI可增加核糖體延伸速率，減少翻譯停滯
CSC	Codon Stabilization Coefficient密碼子穩(wěn)定系數(shù)	基于單個(gè)密碼子的使用頻率與mRNA體外/體內(nèi)半衰期的實(shí)驗(yàn)相關(guān)性，衡量單個(gè)密碼子對(duì)mRNA穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)程度，基因整體CSC為其所有密碼子的平均CSC	1. 唯一直接關(guān)聯(lián)密碼子使用模式與mRNA穩(wěn)定性的指標(biāo)，填補(bǔ)了CAI、tAI僅關(guān)注翻譯效率、忽略mRNA半衰期的空白；2. 揭示規(guī)律：多數(shù)內(nèi)源性mRNA傾向于使用非最優(yōu)密碼子（低CAI/tAI，高CSC），平衡翻譯效率與mRNA穩(wěn)定性；3. 優(yōu)化CSC可提升mRNA的體內(nèi)半衰期，減少降解，延長(zhǎng)蛋白表達(dá)時(shí)間	通用標(biāo)準(zhǔn)方法：1. 通過高通量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大量基因的mRNA半衰期，同時(shí)統(tǒng)計(jì)其密碼子使用頻率；2. 構(gòu)建密碼子頻率-mRNA半衰期的相關(guān)性模型，計(jì)算每個(gè)密碼子的CSC值（正相關(guān)為高CSC，負(fù)相關(guān)為低CSC）；3. 目標(biāo)基因的整體CSC = 基因中所有密碼子的CSC值的算術(shù)平均值	1. 與CAI、tAI協(xié)同優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)“翻譯效率（CAI/tAI）+ mRNA穩(wěn)定性（CSC）”的雙重提升，是mRNA疫苗優(yōu)化的重要補(bǔ)充指標(biāo)；2. 針對(duì)需長(zhǎng)效蛋白表達(dá)的mRNA疫苗/療法（如癌癥疫苗、罕見病療法），優(yōu)先提升CSC；3. 規(guī)避高CAI但低CSC的密碼子組合，防止翻譯效率提升但mRNA快速降解；4. 結(jié)合GC含量?jī)?yōu)化（高GC提升穩(wěn)定性），進(jìn)一步增強(qiáng)CSC的優(yōu)化效果

3.2 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化

3.3 UTR優(yōu)化

uAUGs、uORFs是目的CDS上游的其他翻譯區(qū)域，需要避免CDS外的其他可轉(zhuǎn)錄區(qū)域

3.4 mRNA修飾

mRNA修飾是通過對(duì)核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾，解決天然mRNA穩(wěn)定性差、先天免疫原性過高、翻譯效率不足三大核心問題的關(guān)鍵手段，修飾位點(diǎn)覆蓋整個(gè)mRNA分子，不同修飾類型分工明確、可組合使用。

• mRNA修飾檢測(cè)方法：高通量測(cè)序（mi-CLIP/GLORI/DART-seq）為核心，可實(shí)現(xiàn)單核苷酸分辨率的修飾位點(diǎn)檢測(cè)；傳統(tǒng)方法（HPLC-MS/薄層層析）用于修飾含量定量；
• 修飾類型和位點(diǎn)計(jì)算預(yù)測(cè)：通過MRM-BERT、TransRNAm、DeepMRMP等AI模型，預(yù)測(cè)最優(yōu)修飾位點(diǎn)與組合，減少實(shí)驗(yàn)試錯(cuò)，加速修飾方案的設(shè)計(jì)（如預(yù)測(cè)編碼區(qū)m1Ψ的最優(yōu)替換比例）。

（1）甲基化修飾（最主流的堿基修飾，分腺嘌呤/鳥嘌呤/胞嘧啶甲基化）

（2）核苷異構(gòu)/取代修飾

這類修飾是新冠mRNA疫苗的核心修飾策略，通過替換尿苷等核苷酸，規(guī)避人體先天免疫受體對(duì)病毒RNA的識(shí)別，同時(shí)提升mRNA性能。

（3）其他關(guān)鍵修飾

mRNA遞送系統(tǒng)

• 為什么要使用遞送系統(tǒng)

mRNA自身存在負(fù)電難跨膜、易被核酸酶降解、內(nèi)體逃逸效率低三大遞送障礙，

• 遞送系統(tǒng)的作用

保護(hù)mRNA、實(shí)現(xiàn)靶向遞送、促進(jìn)胞內(nèi)釋放

4.1 mRNA遞送系統(tǒng)主要類型

4.2 LNP遞送系統(tǒng)

LNP是目前mRNA疫苗的首選遞送載體（輝瑞/莫德納新冠疫苗均采用），經(jīng)典配方為四組分

（1）LNP經(jīng)典四組分及核心功能

（2）LNP合成工藝

通過組合化學(xué)方法，系統(tǒng)性生成多樣化可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)（LNP的核心功能成分），構(gòu)建大規(guī)模脂質(zhì)文庫(kù)，為L(zhǎng)NP的高效篩選與優(yōu)化提供物質(zhì)基礎(chǔ)，是連接“脂質(zhì)分子設(shè)計(jì)”與“計(jì)算篩選/實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證”的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

（3）LNP核心優(yōu)化維度與策略

總結(jié)

通過對(duì)本篇綜述的深入學(xué)習(xí)，我系統(tǒng)掌握了 mRNA 腫瘤疫苗從新抗原篩選、DNA 模板制備、mRNA 體外合成與修飾，到 LNP 包封、體內(nèi)遞送、抗原呈遞并激活特異性抗腫瘤免疫的全鏈條機(jī)制，同時(shí)明晰了CDS 序列、UTR 結(jié)構(gòu)、核苷修飾、LNP 遞送體系及制劑工藝等關(guān)鍵優(yōu)化方向。后續(xù)我將持續(xù)更新、分享 mRNA 疫苗研發(fā)領(lǐng)域的最新工具、實(shí)操算法與研究資源。

參考文獻(xiàn)：Accelerate the Highly Efficient Development of mRNA Vaccines Through Advanced Computational Methods
聲明：本分享內(nèi)容來自文獻(xiàn)綜述總結(jié)，不涉及公司機(jī)密內(nèi)容。