1. Study design and single-cell RNA pro!ling of PBMCs.

作者對(duì)采集了3例正常對(duì)照和7例川崎病患者給予IVIG治療前后的外周血，提取PBMC進(jìn)行了單細(xì)胞+TCR BCR 測(cè)序。質(zhì)控之后得到84986細(xì)胞，before IVIG: 34073, after IVIG: 36225, health: 14688。
注釋得到的細(xì)胞群：
T cells: CD3D, CD3E, CD3G (60.00%)
CD4+ T : CD4 (36.94%), CD8+ T: CD8A, CD8B (18.53%)
NK cells: NCAM1 or CD56, KLRB1, NKG7 (5.44%)
B cells: CD19, MS4A1 or CD20, CD38 (22.27%)
monocytes: CD14, CD68, FCGR3A or CD16 (9.60%)
mDCs: CD1C (0.26%)
pDCs: LILRA4 (0.18%)
HSPCs (hematopoietic stem and progenitor cells): CD34 (0.12%)
erythrocytes: HBB (0.99%)
megakaryocytes: PPBP (0.92%)

組間比較結(jié)果顯示：和既往報(bào)道相符，治療前的KD患者單核細(xì)胞和B細(xì)胞比例增加，T細(xì)胞和NK細(xì)胞比例下降。

作者還把這個(gè)數(shù)據(jù)集和一個(gè)已發(fā)表的bulk 基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE73577（使用cDNA microarray檢測(cè)了19個(gè)KD患者給予IVIG治療前后的PBMC），所有基因的fold change在兩組數(shù)據(jù)中呈明顯的正相關(guān) (Pearson’s R = 0.34, P < 2.2 × 10^-16)。兩個(gè)數(shù)據(jù)中1054個(gè)差異表達(dá)基因的相關(guān)性更強(qiáng) (Pearson’s R = 0.74, P < 2.2 × 10^-16)。提示兩個(gè)數(shù)據(jù)集中的數(shù)據(jù)存在著相似的基因表達(dá)模式。

這個(gè)圖是這么做的

通過(guò)把同一樣本所有細(xì)胞的UMI counts直接相加，把scRNAseq的矩陣轉(zhuǎn)化為行為基因，列為樣品的bulk RNAseq的矩陣，然后使用DESeq2計(jì)算給予IVIG前后基因的fold change。
再和GSE73577中測(cè)的基因的fold change做相關(guān)性分析。

2. Dynamics of major PBMC immune cell types.

Fig 2A：隨后作者比較了不同細(xì)胞群治療前后的比例變化。KD患者外周血B細(xì)胞和正常相比出現(xiàn)明顯上升，IVIG治療后下降至正常。IVIG治療后CD4T細(xì)胞比例上升。和正常相比，KD患者的CD8T細(xì)胞比例下降，治療后出現(xiàn)回升。KD患者的NK細(xì)胞比例也出現(xiàn)下降。
Fig 2B：流式結(jié)果和單細(xì)胞的結(jié)果一致。
Fig 2C：既往文獻(xiàn)報(bào)道IVIG治療后外周血單核細(xì)胞比例會(huì)下降，但是P1患者在治療后出現(xiàn)了上升。為了排除潛在的技術(shù)偏差，作者找到了患者血常規(guī)的數(shù)據(jù)，和單細(xì)胞的數(shù)據(jù)是一致的。

3. Monocyte subsets and responses

Fig 3A： 把單核細(xì)胞進(jìn)一步分為了CD14單核和CD16單核。盡管正常和治療前的PBMC中CD16沒(méi)有明顯差別，IVIG治療后CD16單核的比例顯著下降。
Fig 3B： 隨后作者做了單核細(xì)胞的差異分析，展示了一部分差異基因。治療前的KD患者出現(xiàn)了S100蛋白，免疫球蛋白受體，細(xì)胞因子受體，補(bǔ)體受體的上調(diào)和MHC II受體的下調(diào)。細(xì)胞因子的表達(dá)異質(zhì)性比較大，一些細(xì)胞因子包括IFNAR2, IFNGR2, IL3RA, IL10RB和CX3CR1在治療前的患者中表達(dá)比較高，一些細(xì)胞因子如IL7R, IL13RA1, IL6ST, 和CXCR3則在治療后和正常患者中表達(dá)比較高。
Fig 3C：高細(xì)胞因子血癥是KD的一個(gè)重要特征，作者查看了一些細(xì)胞因子在不同細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它們主要來(lái)自于單核細(xì)胞。IL1B和TNF這兩個(gè)在KD中比較重要的細(xì)胞因子也在單核細(xì)胞中比較高。
Fig 3D：IL1B和TNF主要是在治療前的KD患者外周血比較高

4. B-cell subsets and BCR repertoires.

這部分分析了B細(xì)胞，將外周血B細(xì)胞細(xì)分為了4個(gè)亞群
Bn: MS4A1, TCL1A (62.73%)
Bm: MS4A1, CD27, IGHA1, IGHG1 (17.27%)
plasma cells: CD27, CD38, IGHA1, IGHG1 (6.24%)
intermediate between naive and memory cells (13.77%)
Fig 4A B：IVIG治療后，漿細(xì)胞的比例上升，這個(gè)結(jié)果在20HC和16KD患者的外周血數(shù)據(jù)中也做了流式驗(yàn)證，結(jié)果一致。
Fig 4C：B細(xì)胞的差異基因。治療前的樣品出現(xiàn)了一些細(xì)胞周期相關(guān)基因的上調(diào)（比如CCND2, RRM2, CENPM, NME1, CKS1B和MYC）和抑制細(xì)胞周期相關(guān)基因的下調(diào)（BTG2和CDKN1B）。這個(gè)現(xiàn)象和前面Fig 2中B細(xì)胞比例增加相一致。
Fig 4D：IGHA和IGHG在IVIG治療后出現(xiàn)了明顯上調(diào)。提示存在從IgM/IgD到IgG/IgA的表型轉(zhuǎn)變。
Fig 4E：BCR的分析結(jié)果提示多數(shù)病人（除了P7）的BCR克隆在治療后都出現(xiàn)明顯增加。而且存在著單克隆擴(kuò)增，尤其是IgA和IgG isotype。擴(kuò)增克隆的IGHV基因usage在不同病人間存在異質(zhì)性，在KD患者和HC中也沒(méi)有明顯差異。提示specific B-cell reactions而不是responses to a superantigen。

5. T- and NK-cell subsets and TCR repertoires.

對(duì)CD4⁺T, CD8⁺T和NK細(xì)胞做了亞群細(xì)分。CD4⁺T和CD8⁺T都分出了三個(gè)亞群：
naive cells: CCR7, SELL (70.41%)
central memory cells: 共表達(dá)CCR7, SELL和S100A4 (12.04%)
effector memory cells: S100A4 (6.54%)
CD8⁺Tm還高表達(dá)細(xì)胞毒性相關(guān)基因：GZMK和GZMB
此外還鑒定出了：
CD4^+^Treg: FOXP3 (3.51%)
γδ T cells: TRDC (5.34%)
proliferating T cells: TYMS (2.15%)
Fig 5A B：和HC相比，KD患者外周血CD8⁺Tn顯著增加，CD8⁺Tem顯著減少。流式驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)果。提示外周血CD8⁺T的下降主要是具有殺傷效應(yīng)的CD8⁺Tem的下降。
Fig 5C D：分開(kāi)CD4和CD8計(jì)算了差異基因和功能富集，兩類(lèi)細(xì)胞表達(dá)模式基本相似。
Fig 5E：挑了個(gè)感興趣的基因看了表達(dá)變化
Fig 5F：TCR的分析