1、獲得vcf文件，找到兩個差異材料（雙親）之前的多態(tài)性位點SNP。
（1）SNP可以根據(jù)測序深度、基因型等進行過濾，測序深度異常（特別是過低的）位點直接過濾掉；
（2）選擇在兩個親本中基因型為純合不一樣的（一個親本為0/0，另外一個為1/1）；如果有混池或者F2等，可以參照表型和基因型對應篩選，可以輔助選擇位點的正確率。
（3）如果相近SNP基因型在雙親中一致，我們可以認為是bin，選擇其中質量最高的（可用的）SNP即可。

2、從基因組文件中獲取目標區(qū)間的序列。

3、根據(jù)SNP位點位置，獲取其上下游各30bp序列，然后通過dCAPS Finder 2.0在線網(wǎng)站dCAPS進行單端引物設計; 可以選擇人工錯配，錯配0為CAPS標記，錯配1-2都可以開發(fā)給dCAPS標記。
選擇目標引物，保存序列和酶切位點及限制性內切酶信息。

4、根據(jù)dCAPS Finder 2.0設計的單端標記，再進一步設計另外一端標記，構成引物對。產(chǎn)物建議在90-400bp之間。引物設計遵循引物設計基本原則：
（1）引物長度18-30bp；
（2）一對引物的兩個Tm值應該相近，差異最好在1-2°C之內；
（3）GC含量在40%-60%。50%左右最為理想。GC含量過高（>60%）會使引物過于穩(wěn)定，可能引發(fā)非特異性退火；過低（<40%）則結合力太弱；
（4）3‘末端的最后1-2個堿基最好是G或C，即形成強的GC堿基對。這被稱為“GC clamp”，能增強引物與模板的結合強度，提高擴增特異性；
（5）引物內部沒有4個以上連續(xù)的堿基。

5、雙端引物設計后，
（1）檢查在目標產(chǎn)物內有沒有目標酶切位點，如果有是否會影響結果判斷，如果會影響雙親或者F1基因型判斷，需要重新設計引物。
（2）檢測引物特異性，可以通過基因組blast或者相關基因組網(wǎng)站上的小軟件。