二代高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于疾病和癌癥的研究，但由于其短讀長(zhǎng)的特點(diǎn)，對(duì)結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)有一定的局限性。以Pacbio和ONT為代表的三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)彌補(bǔ)了這一不足，但因成本相對(duì)較高限制了其廣泛應(yīng)用。三代目標(biāo)區(qū)域測(cè)序技術(shù)，不僅保留了長(zhǎng)讀長(zhǎng)的測(cè)序優(yōu)勢(shì)，又可以針對(duì)感興趣的基因或區(qū)域以更高的性價(jià)比進(jìn)行高深度測(cè)序研究。目前，三代目標(biāo)區(qū)域測(cè)序技術(shù)已被應(yīng)用于疾病或癌癥領(lǐng)域HLA、STR、融合基因、甲基化檢測(cè)等研究中。目標(biāo)區(qū)域富集的方法主要有三類：長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增、CRISPR/Cas9靶向捕獲和液相探針捕獲。下面為大家進(jìn)行一一介紹。
長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增
長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增因其引物設(shè)計(jì)成本低，實(shí)驗(yàn)流程規(guī)范，是基因組靶向富集常用的方法之一。但PCR過程中容易產(chǎn)生嵌合體、出現(xiàn)參考比對(duì)偏差[1]，此外，基因組的復(fù)雜區(qū)域和高GC區(qū)域往往會(huì)影響PCR擴(kuò)增效果，制約了其應(yīng)用范圍。長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增一般適用于非復(fù)雜區(qū)域變異檢測(cè)研究。
Long-Read Nanopore Sequencing Validated for Human Leukocyte Antigen Class I Typing in Routine Diagnostics[2]
發(fā)表期刊：The Journal of Molecular Diagnostics（IF:5.561）??
發(fā)表時(shí)間：2020年7月
人類白細(xì)胞抗原(HLA)的高分辨率分析是確定造血干細(xì)胞移植患者和供者相容性的金標(biāo)準(zhǔn)。Nanopore長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序能夠直接跨越HLA區(qū)域，提供明確分型，但堿基的高錯(cuò)誤率限制了其應(yīng)用。該文章中第一階段，選擇已知HLA分型的33例樣本，針對(duì)HLA I類基因HLA-A、HLA-B、HLA-C進(jìn)行了特定基因全長(zhǎng)擴(kuò)增（擴(kuò)增引物見表1），使用MinION 1D2建庫(kù)試劑盒（SQK-LSK308）建庫(kù)，MinION測(cè)序，使用2種HLA分析軟件JSI和GenDx進(jìn)行HLA分型分析，結(jié)果表明其分型結(jié)果與前期Sanger測(cè)序分型結(jié)果100%一致（表2），MinINO測(cè)序和分析流程圖見圖1。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該方法，第二階段選擇了67例臨床樣本進(jìn)行MinION測(cè)序分析，與Sanger測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致，該結(jié)果進(jìn)一步表明了納米孔測(cè)序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到可以用于常規(guī)診斷并具有較高的準(zhǔn)確性。
表1 擴(kuò)增引物
表2 33例樣本MinION分型結(jié)果和Sanger分型結(jié)果對(duì)比（僅展示前3行）
CRISPR/Cas9靶向捕獲
Cas9靶向捕獲技術(shù)，首先將DNA末端去磷酸化，然后用Cas9/guideRNA復(fù)合物引入新的切口，將測(cè)序接頭特異性連接到剪切區(qū)域，從而達(dá)到靶向測(cè)序的效果。該技術(shù)無(wú)PCR擴(kuò)增環(huán)節(jié)，可以同時(shí)進(jìn)行結(jié)構(gòu)變異、STR及堿基修飾鑒定等研究。
Targeted Nanopore Sequencing with Cas9-guided Adapter Ligation[3]
發(fā)表期刊：Naute Biotechnology（IF:54.9）
發(fā)表時(shí)間：2020年4月
目前的測(cè)序方法仍然受到無(wú)法檢測(cè)堿基修飾，讀長(zhǎng)過短，核酸總量要求高，產(chǎn)量過低或?qū)嶒?yàn)流程過長(zhǎng)等限制。該文章中作者開發(fā)了一種基于Cas9靶向捕獲的納米孔序列方法（nanopore Cas9-targeted sequencing，nCATS），該方法使用基于CRISPR–Cas9的靶向DNA捕獲策略（圖2A），將捕獲的DNA進(jìn)行納米孔長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序。該文章表明nCATS技術(shù)可以同時(shí)進(jìn)行SNP，SV，單體型和CpG甲基化鑒定。文章中研究發(fā)現(xiàn)多種guideRNAs組合可將?KRT19基因的覆蓋率從47X提高到407X（圖2B），MinION整個(gè)cell的覆蓋率中位數(shù)提升到680X（圖2C）。文章中將nCATS方法在GM12878細(xì)胞系上檢測(cè)的SNV與白金數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較，驗(yàn)證了雙鏈數(shù)據(jù)過濾后SNP檢測(cè)的準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示只有一個(gè)假陽(yáng)性位點(diǎn)存在于胸腺嘧啶密集的均聚物區(qū)域。將nCATS甲基化數(shù)據(jù)與WGBS數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示每個(gè)CpG相關(guān)性為0.81。該方法將促進(jìn)長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究和臨床中的應(yīng)用。
液相探針捕獲
針對(duì)感興趣的基因或區(qū)域定制特異性探針，通過探針與基因組DNA進(jìn)行雜交，將目標(biāo)區(qū)域片段捕獲富集后進(jìn)行測(cè)序分析研究。但該技術(shù)由于建庫(kù)環(huán)節(jié)中存在PCR擴(kuò)增環(huán)節(jié)，會(huì)丟失堿基修飾信息，且需要額外考慮定制探針的周期。
Efficient Sequencing, Assembly, and Annotation of Human KIR Haplotypes[4]
發(fā)表期刊：Frontiers in Immunology（7.561）
發(fā)表時(shí)間：2020年10月
天然殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)區(qū)域具有高度同源性、重組率、多態(tài)性及重復(fù)序列等特點(diǎn)，利用二代高通量測(cè)序不能得到完整的單倍型信息。文章中提出了一種自主設(shè)計(jì)探針捕獲目標(biāo)區(qū)域，利用長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序來(lái)組裝人類二倍體KIR單倍型的新方法。該方法設(shè)計(jì)了18個(gè)捕獲探針來(lái)捕獲KIR區(qū)間長(zhǎng)度為2-8kb的DNA片段。采用PacBio Sequel平臺(tái)CCS模式進(jìn)行測(cè)序，使用Canu軟件進(jìn)行組裝，按照KIR基因劃分區(qū)域，基于每個(gè)基因和KIR全長(zhǎng)進(jìn)行組裝，最后注釋序列的位置信息。為了評(píng)估該流程的可靠性，作者對(duì)16個(gè)樣本（單倍型信息已知）進(jìn)行組裝和注釋評(píng)估。組裝結(jié)果表明，僅使用18個(gè)探針對(duì)KIR區(qū)域進(jìn)行捕獲，就覆蓋了參考基因組的97%，序列一致性為99.97%。該研究所提出的靶向探針捕獲測(cè)序方法是第一個(gè)對(duì)人類所有KIR二倍體進(jìn)行完整測(cè)序和組裝的方法，可以有效地應(yīng)用于人群規(guī)模研究和臨床研究中。
綜上，三代目標(biāo)區(qū)域測(cè)序技術(shù)有PCR擴(kuò)增，Cas9靶向捕獲和探針液相捕獲三類靶向富集方法，其優(yōu)劣勢(shì)總結(jié)如下（表3），可結(jié)合具體研究需求進(jìn)行選擇。
表3不同目標(biāo)區(qū)域捕獲方法比較匯總
參考文獻(xiàn)
[1]Laver TW, Caswell RC, Moore KA,et al.Pitfalls of haplotype phasing from amplicon-based long-read sequencing[J]. Scientific?Reports. 2016;17(6):21746.?
[2]Matern BM, Olieslagers TI, Groeneweg M, et al. Long-Read Nanopore Sequencing Validated for Human Leukocyte Antigen Class I Typing in Routine Diagnostics[J].The Journal of Molecular Diagnostics. 2020 ;22(7):912-919.?
[3]Gilpatrick T, Lee I, Graham JE, et al. Targeted nanopore sequencing with Cas9-guided adapter ligation[J]. Naute Biotechnology. 2020;38(4):433-438.?
[4]Roe D, Williams J, Ivery K, et al. Efficient Sequencing, Assembly, and Annotation of Human KIR Haplotypes[J]. Frontiers in Immunology . 2020;9(11):582927.?
