Changes in the Mitochondrial Dynamics and Functions Together with the mRNA/miRNA Network in the Heart Tissue Contribute to Hypoxia Adaptation in Tibetan Sheep
DOI: 10.3390/ani12050583

Simple Summary

長期暴露在缺氧環(huán)境下，是細(xì)胞壓力的主要來源，可誘發(fā)與缺氧有關(guān)的疾病，甚至死亡。線粒體在介導(dǎo)對缺氧的能量生產(chǎn)反應(yīng)中起著重要作用，但對其中的機(jī)制知之甚少。藏羊主要分布在青藏高原，經(jīng)過長期的適應(yīng)，藏羊?qū)θ毖跤泻芎玫倪m應(yīng)性。在這項(xiàng)工作中，我們對不同海拔地區(qū)藏羊的血液指標(biāo)、組織形態(tài)、mRNA和miRNA表達(dá)調(diào)控以及線粒體功能的變化進(jìn)行了系統(tǒng)分析，以深入了解動物對缺氧的適應(yīng)機(jī)制和缺氧相關(guān)疾病的進(jìn)展。

摘要

本研究旨在通過探索不同海拔藏羊的缺氧適應(yīng)機(jī)制、血液指標(biāo)、組織形態(tài)學(xué)、mRNA/miRNA調(diào)控、線粒體動力學(xué)和功能變化，為缺氧條件下的分子調(diào)控和線粒體功能提供新見解。血液指標(biāo)和心肌形態(tài)學(xué)方面，高原綿羊的 HGB、HCT、CK、CK-MB、LDH、LDH1、SOD、GPX、LDL 水平和心肌毛細(xì)血管密度顯著升高（ p < 0.05 ）。RNA-seq 結(jié)果表明，DEmRNAs 和 DEmiRNAs 主要與 PI3K-Akt、Wnt 和 PPAR 信號通路以及癌基因（CCKBR、GSTT1、ARID5B）的上調(diào)有關(guān)) 和腫瘤抑制因子 ( TPT1、EXTL1、ITPRIP ) 來增強(qiáng)細(xì)胞代謝并增加 ATP 的產(chǎn)生。分析 mRNA-miRNA 協(xié)同調(diào)節(jié)表明線粒體動力學(xué)和功能顯著豐富。通過分析線粒體動力學(xué)，隨著海拔升高，心臟中的線粒體融合顯著增加，裂變顯著減少 ( p < 0.05)。隨著海拔的升高，線粒體密度顯著增加，單個(gè)線粒體嵴的平均面積、縱橫比、數(shù)量和寬度顯著降低（p< 0.05)。隨著海拔升高，各組織中NADH、NAD+和ATP含量、NADH/NAD+比值和CO活性顯著升高，而SDH和CA活性顯著降低（p< 0.05)。因此，發(fā)現(xiàn)藏羊血液指標(biāo)和心肌形態(tài)的變化可以提高血紅蛋白攜帶氧氣的效率并減少氧化應(yīng)激。癌基因和抑癌因子的高表達(dá)可能促進(jìn)細(xì)胞分裂和能量交換，這從增強(qiáng)的線粒體分裂和 OXPHOS 表達(dá)中可以明顯看出；然而，它減少了融合和 TCA 循環(huán)，以進(jìn)一步快速產(chǎn)生 ATP 以適應(yīng)缺氧脅迫。該系統(tǒng)研究首次闡明了藏羊心臟缺氧適應(yīng)機(jī)制，對于提高哺乳動物缺氧適應(yīng)能力和研究線粒體在缺氧條件下的動態(tài)調(diào)控具有重要意義。

介紹

氧氣是哺乳動物正常有氧代謝所必需的，主要是線粒體有氧代謝產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP）以維持細(xì)胞的正常生理功能。缺氧是自然界中普遍存在的自然現(xiàn)象。氧氣濃度隨海拔升高而逐漸降低，海拔4000米處的氧氣含量僅為海平面的60% [ 1]. 長期處于高原缺氧狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞供氧不足，導(dǎo)致動物組織損傷甚至死亡。同時(shí)，缺氧在癌細(xì)胞的發(fā)育過程中更為常見。由于惡性增殖，癌細(xì)胞相互競爭氧氣，導(dǎo)致缺氧微環(huán)境。目前，許多抗癌藥物的研究都是針對癌細(xì)胞的能量代謝[ 2 ]。因此，研究缺氧適應(yīng)機(jī)制對于提高動物適應(yīng)缺氧能力和腫瘤相關(guān)醫(yī)學(xué)研究具有重要意義。

長期暴露于缺氧環(huán)境會誘發(fā)各種以紅細(xì)胞增多癥和肺水腫為特征的急性高山病 (AMS)。[然而，藏羊 3 ] 和藏豬 [4]等高原本土哺乳動物的長期適應(yīng)性進(jìn)化]從形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化、遺傳學(xué)等方面保證了它們對高原缺氧的系統(tǒng)適應(yīng)。藏羊主要分布在海拔2500～4500米的青藏高原及鄰近地區(qū)。據(jù)報(bào)道，它們是經(jīng)過長期適應(yīng)后從野生綿羊中衍生出來的，其種群數(shù)量估計(jì)超過5000萬只。此外，這些羊不僅能很好地適應(yīng)高原缺氧環(huán)境，還能為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┤?、毛、奶，成為?dāng)?shù)啬撩竦闹饕?jīng)濟(jì)來源之一[ 3、5 ]。這些特性使藏羊成為研究缺氧適應(yīng)的理想模式生物。

近年來，據(jù)報(bào)道轉(zhuǎn)錄組學(xué)在揭示許多細(xì)胞事件方面具有重要作用。轉(zhuǎn)錄分析揭示了適應(yīng)缺氧環(huán)境所需的缺氧調(diào)節(jié)因子的差異表達(dá) [ 6 ]。據(jù)報(bào)道，缺氧誘導(dǎo)因子 1 (HIF-1)、磷酸肌醇 3-激酶-Akt (PI3K-Akt) 和過氧化物酶體增殖物激活受體 (PPAR) 信號通路 [7、8 ]與缺氧密切[相關(guān)]并且miR-21-5p [ 9 ]、miR-200b/C[ 10 ] 和 miR-21[ 11 ]等 miRNA已被證明在調(diào)節(jié)缺氧中發(fā)揮重要作用。

葡萄糖代謝和糖酵解的變化被上調(diào)以產(chǎn)生 ATP 以抵抗缺氧應(yīng)激 [ 12 ]。線粒體是具有其基因組和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的雙層膜細(xì)胞器。它可以利用三羧酸（TCA）循環(huán)和氧化磷酸化（OXPHOS）產(chǎn)生細(xì)胞所需的大部分ATP（95%）以滿足細(xì)胞的能量需求[ 13 ]。同時(shí)，線粒體還調(diào)節(jié)活性氧 (ROS) 的產(chǎn)生和儲存、鈣穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞凋亡 [ 14、15 ]。線粒體動力學(xué)是細(xì)胞適應(yīng)缺氧的一個(gè)重要方面。融合和裂變的速率受視神經(jīng)萎縮 1 (OPA1)、動力蛋白相關(guān)蛋白 1 (Drp1) 和裂變 1 (Fis1) 等關(guān)鍵蛋白的調(diào)節(jié) [ 16、17 ]。線粒體融合與裂變在生理?xiàng)l件下相互制約，使線粒體達(dá)到一定的動態(tài)平衡，補(bǔ)充和修復(fù)線粒體DNA（mtDNA），調(diào)節(jié)TCA循環(huán)和OXPHOS，為細(xì)胞提供能量，滿足細(xì)胞的能量需求。[ 18 ]。破壞這種平衡，即當(dāng)線粒體融合和分裂受阻時(shí)，會導(dǎo)致多種疾病 [ 19 ]。

目前對缺氧適應(yīng)的研究主要集中在血液指標(biāo)、組織形態(tài)學(xué)和基因表達(dá)等方面，以線粒體為切入點(diǎn)通過能量傳輸進(jìn)行缺氧適應(yīng)的研究較少。因此，本研究以藏羊?yàn)槟Ｐ停瑢⑵鋷У讲煌０胃叨龋ú煌鯘舛龋?，分析心臟mRNA和miRNA的表達(dá)譜，結(jié)合線粒體動力學(xué)和功能，探討缺氧適應(yīng)機(jī)制，從而為發(fā)展畜牧業(yè)和防治缺氧相關(guān)疾病提供參考。

(個(gè)人關(guān)注討論部分，結(jié)果和方法見原文)

討論

4.2. 缺氧條件下 mRNA 和 miRNA 的適應(yīng)性調(diào)節(jié)

基因?qū)τ谡{(diào)節(jié)表型很重要，例如 VEGF 的表達(dá)和HIF-1a和HIF-1b的共表達(dá)，促進(jìn)血管生成和纖維化以增加對組織的供氧 [ 36 ]?；趍RNAs/miRNAs的缺氧研究主要集中在人類癌癥[ 37 ]、藏豬[ 20 ]和水生生物[ 38 ]，而藏羊研究較少。在這項(xiàng)研究中，TS25、TS35 和 TS45 中的藏羊平均產(chǎn)生了 41.22、41.32 和 4315 萬個(gè) clean reads，與 Lin 等人獲得的約 4700 萬個(gè) clean reads 的結(jié)果相似。[ 39] 在山羊肌肉組織中。盡管RNA來源不同，但相似的結(jié)果表明測序結(jié)果可用于后續(xù)研究。通過測序共獲得18140個(gè)mRNA，然后對三組中的DEmRNA進(jìn)行鑒定并注釋其功能。在 TS25-vs-TS35 和 TS25-vs-TS45 結(jié)果中，5 個(gè)最顯著的差異表達(dá)基因主要與癌癥相關(guān)并在致癌過程中起作用（白血病、胃癌、乳腺癌等）（CCKBR 、 GSTT1 、 ARID5B ） , TPT1 , EXTL1 ), 抗氧化劑 ( GPX1 , SELENOW ), 血管生成 ( ANGPTL2 , PTX3), 和紅細(xì)胞形態(tài)學(xué) ( SELENOW )。然而，癌癥相關(guān)基因的高表達(dá)并不代表癌癥的發(fā)病率高，也不代表細(xì)胞為了滿足組織細(xì)胞的能量需求而高表達(dá)而處于更高的代謝水平。王等(2019) [ 40 ] 在鹿研究中發(fā)現(xiàn)癌癥相關(guān)基因和通路被顯著注釋以滿足鹿茸組織的快速生長。同時(shí)，抑癌基因也被強(qiáng)烈選擇，這解釋了為什么癌癥和抑癌基因在我們的結(jié)果中顯著豐富。此外，TS35-vs-TS45結(jié)果中差異表達(dá)最顯著的基因主要與血管保護(hù)相關(guān)（Nr4a3，SCN3B )和維持或改變組織形態(tài)( DDIT4L , Myh6 )，這可能是由于海拔3500米到4500米急性缺氧應(yīng)激的適應(yīng)階段，類似于癌細(xì)胞增殖的緩慢后期。例如，SCN3B在 TS35 羊中的表達(dá)量是 TS45 羊的 10.46 倍，較低的SCN3B表達(dá)量可以保護(hù)顱內(nèi)動脈內(nèi)皮細(xì)胞免于心肌動脈粥樣硬化 [ 41]. 適當(dāng)?shù)男募》屎窨梢栽鰪?qiáng)心臟功率，加速血流和組織供血，是組織因缺氧應(yīng)激而產(chǎn)生的代償性變化。作為組織對缺氧反應(yīng)的代償性變化，適當(dāng)?shù)男募》屎窨稍鰪?qiáng)心功率。研究已經(jīng)確定DDIT4L的表達(dá)促進(jìn)心肌肥大以應(yīng)對壓力 [ 42 ]。

分析 GO 和 KEGG 以更好地了解 DEmRNA 的功能。結(jié)果表明，DEmRNAs主要富集于癌癥、PI3K-Akt、PPAR、MAPK、鈣離子、camp、代謝等缺氧相關(guān)通路，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮結(jié)合、催化和分子調(diào)控等相關(guān)功能。 、細(xì)胞器和細(xì)胞膜響應(yīng)生物調(diào)節(jié)和應(yīng)激等生物過程。這些途徑已被注釋為在缺氧和癌細(xì)胞發(fā)展中具有重要的調(diào)節(jié)作用 [43]]. 值得注意的是，癌癥通路中的microRNAs在不同的缺氧脅迫下顯著富集，這也說明miRNAs在缺氧過程中發(fā)揮著重要作用。miRNA通過與靶mRNA的某些堿基配對來降解或抑制mRNA翻譯，從而在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中發(fā)揮負(fù)面作用[ 44 ]。因此，對不同海拔條件下藏羊心臟miRNAs的轉(zhuǎn)錄組譜進(jìn)行了測定，共獲得1046個(gè)miRNAs。為了進(jìn)一步了解 miRNA 調(diào)控，分析了 DEmiRNA 和 DEmRNA 之間的關(guān)聯(lián)，并構(gòu)建了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

網(wǎng)絡(luò)中 mRNA 功能的分析表明，雖然大多數(shù)與 miRNA 相關(guān)性最強(qiáng)的 mRNA 也與癌癥和腫瘤發(fā)生有關(guān)，但這些 mRNA 與葡萄糖代謝和氧化磷酸化（ MRPL28 、 ALDH1L2 、 ECI1 、 PDP2 ）更具體相關(guān)和線粒體動力學(xué)（TIMM8A、MTFP1、Fis1、ErbB）。例如，作為一種線粒體蛋白，MRPL28可以作為開發(fā)胃癌新藥的靶點(diǎn)[ 45 ]。PDP2高表達(dá)能抑制丙酮酸脫氫酶 (PDH) 的活性，進(jìn)而減弱線粒體中利用丙酮酸減弱細(xì)胞呼吸和 OXPHOS 的強(qiáng)度 [ 46 ]。本研究中PDP2的表達(dá)隨海拔升高而降低，這可能與線粒體OXPHOS有關(guān)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中靶基因的功能注釋，主要位于線粒體的mRNA參與癌癥、Wnt、cAMP、FOXO、ErbB和鈣調(diào)節(jié)信號通路，在血管生成、蛋白磷酸化和線粒體動力學(xué)中起關(guān)鍵作用規(guī)定。Ludikhuize 等(2020) [ 47]發(fā)現(xiàn)FOXO和Wnt信號通路在Lgr5+柱狀細(xì)胞（CBCS）的線粒體裂變中發(fā)揮重要作用，導(dǎo)致干細(xì)胞分化為杯狀細(xì)胞。EGF/ErbB信號通路在缺氧條件下被激活，誘導(dǎo)磷酸甘油酸激酶1（PGK1）S203磷酸化并轉(zhuǎn)移至線粒體，從而導(dǎo)致丙酮酸脫氫酶激酶磷酸化，從而增強(qiáng)丙酮酸向線粒體和TCA的轉(zhuǎn)移周期 [ 48 ]。在本研究中， PGK1的表達(dá)與 TS25 羊相比，TS45 羊中的 1.59 倍下調(diào)，表明丙酮酸向線粒體的轉(zhuǎn)移減弱。從構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)圖中，線粒體被識別為調(diào)節(jié)與適應(yīng)缺氧條件相關(guān)的動力學(xué)和功能。因此，在缺氧條件下分析了線粒體動力學(xué)和功能的動態(tài)變化。

4.4 缺氧條件下 TCA 循環(huán)下調(diào)，OXPHOS 上調(diào)

我們之前的研究發(fā)現(xiàn)HIF1A和PDK4協(xié)同表達(dá)促進(jìn)糖酵解[ 12 ]。作為一種激酶，PDK4 使丙酮酸脫氫酶氧化和脫羧以降低其活性，最終減少 CA 合成。本研究中 CA 含量隨著海拔高度的增加而顯著降低，這表明 TCA 循環(huán)可能在缺氧條件下減弱。本研究中PDK4的表達(dá)與 CA 含量呈負(fù)調(diào)控關(guān)系，證明缺氧條件下 TCA 循環(huán)可能下調(diào)，減少癌細(xì)胞中 TCA 循環(huán)以減少耗氧量也是適應(yīng)的重要調(diào)控策略。缺氧 [ 59]. OXPHOS主要依賴于線粒體內(nèi)膜呼吸鏈的四種復(fù)合物和ATP合酶。OXPHOS 率的變化可以通過根據(jù)海拔測量關(guān)鍵復(fù)合物的含量/活性來識別。復(fù)合物 1 (NADH) 是呼吸鏈中最大的。在這項(xiàng)研究中，NADH 和 NAD+ 含量隨著海拔高度的升高而顯著增加，表明 OXPHOS 可能被上調(diào)。因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)NAD的氧化還原狀態(tài)是調(diào)節(jié)糖代謝的關(guān)鍵因素[ 60 ]，高NADH/NAD+含量表明OXPHOS上調(diào)，NAD+活性的增加也可以增強(qiáng)線粒體功能，增加ATP的產(chǎn)生[ 61]. Complex 2 (SDH) 是電子進(jìn)入呼吸鏈的第二個(gè)獨(dú)立入口。雖然SDH本身不產(chǎn)生質(zhì)子，但它可以直接氧化琥珀酸，將電子轉(zhuǎn)移給輔酶Q[ 62 ]。在這項(xiàng)研究中，SDH 的活性隨海拔升高而降低，并在心臟、肺和股四頭肌中達(dá)到顯著水平。缺氧條件下 SDH 活性的降低會減少琥珀酸的氧化，從而減少 ROS 的產(chǎn)生并降低線粒體膜維持線粒體功能的潛力 63 []。

TCA 循環(huán)的減少減少了質(zhì)子進(jìn)入線粒體膜間隙的產(chǎn)生，這進(jìn)一步降低了膜電位。此外，SDH 活性的降低也可能與 TCA 循環(huán)減弱有關(guān)，這會降低琥珀酸和 SDH 活性。復(fù)合物 4 (CO) 是唯一的組織特異性復(fù)合物，參與調(diào)節(jié)發(fā)育。作為限速酶，有一個(gè)伴隨的作用來調(diào)節(jié) OXPHOS 的速率 [ 64]. 發(fā)現(xiàn)所有五種組織中的 CO 活性顯著增加，這證明 OXPHOS 過程在缺氧條件下顯著上調(diào)。然而，確定單個(gè)線粒體嵴的數(shù)量和寬度的減少是否可以降低 OXPHOS 水平。推測 TS45 藏羊中存在更多線粒體。因此，全身線粒體嵴的數(shù)量和寬度可能會增加，表明 OXPHOS 水平得到改善。ATP含量需要顯著增加以滿足組織細(xì)胞的能量需求和抵抗應(yīng)激，但缺氧條件下的產(chǎn)生機(jī)制尚不十分清楚。在所有組織中測量了 ATP 含量，并隨著海拔高度的增加而顯著增加。

雖然結(jié)果表明線粒體動力學(xué)和功能的變化在缺氧環(huán)境中起著重要作用，但動物死亡引起的壓力可能會影響線粒體，許多麻醉劑和毒素對線粒體是致命的。因此，應(yīng)盡可能減少外界環(huán)境對線粒體的影響。此外，雖然這項(xiàng)研究模擬了不同海拔高度的不同氧氣含量，但由于物種特異性，結(jié)果可能不適用于其他哺乳動物或癌細(xì)胞的發(fā)展。因此，其他哺乳動物線粒體的變化還需進(jìn)一步研究，但缺氧條件下藏羊線粒體的調(diào)控可以為缺氧相關(guān)疾病的治療提供參考。

結(jié)論

綜上所述，藏羊血液中紅細(xì)胞和血紅蛋白數(shù)量、抗氧化劑濃度和心肌毛細(xì)血管的增加可能會提高氧氣運(yùn)輸效率并減少 ROS 造成的損害。根據(jù)mRNA-seq和miRNA-seq的結(jié)果，藏羊主要依靠PI3K-Akt、Wnt、PPAR信號通路上調(diào)癌基因和抑癌基因來增強(qiáng)細(xì)胞代謝，增加ATP的產(chǎn)生和從而抵抗缺氧引起的壓力。這些基因主要通過調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)和功能來發(fā)揮這一作用，例如線粒體裂變增加，融合減少，糖酵解和 OXPHOS 上調(diào)，TCA 循環(huán)下調(diào)。