類固醇激素雌激素通過(guò)雌激素受體（ER）在各種基本的發(fā)育和生理過(guò)程以及許多疾病狀態(tài)中起作用。 哺乳動(dòng)物表達(dá)兩種ER亞型，即 ERα 和 ERβ，它們表現(xiàn)出不同的組織特異性表達(dá)模式和生物學(xué)作用。ER主要作為核轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，其被天然配體17β-雌二醇 （E2） 結(jié)合后二聚化，并作為基因表達(dá)的有效調(diào)節(jié)因子。ERα與整個(gè)基因組中的 > 10,000 個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，并起以下作用：（1） 促進(jìn)介導(dǎo)組蛋白或其他轉(zhuǎn)錄因子翻譯后修飾的共調(diào)節(jié)因子的募集，以及 （2） 調(diào)節(jié)RNA 聚合酶Ⅱ （Pol Ⅱ） 轉(zhuǎn)錄機(jī)制的結(jié)合或活性，最終改變雌激素反應(yīng)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組。

先前分析存在和不存在 E2 的穩(wěn)態(tài)基因表達(dá)模式的研究未能揭示雌激素調(diào)節(jié)基因集的一致觀點(diǎn)。特別是，表達(dá)微陣列的使用在廣泛使用的 ERα 陽(yáng)性 MCF-7 人乳腺癌細(xì)胞系中產(chǎn)生了雌激素調(diào)節(jié)基因的數(shù)量差異，范圍從 100 到 1500 （Cheung & Kraus，2010, Kininis & Kraus，2008)。此外，ERα 和 Pol Ⅱ 的基因組 ChIP 分析也沒(méi)有清楚地了解雌激素調(diào)節(jié)的基因集。這在一定程度上是由于難以將 ERα 結(jié)合事件分配給特定的基因調(diào)控結(jié)果。 這些分析的另一個(gè)局限性是，它們專注于雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)Pol Ⅱ 轉(zhuǎn)錄的影響，而沒(méi)有考慮對(duì)Pol Ⅰ 和Pol Ⅲ 的潛在影響。

通過(guò)評(píng)估成熟 mRNA 的變化來(lái)監(jiān)測(cè)雌激素依賴性基因表達(dá)的一個(gè)基本弱點(diǎn)是，需要更長(zhǎng)的處理時(shí)間才能留出 mRNA 積累的時(shí)間（～3-24 小時(shí)）。這段時(shí)間允許來(lái)自刺激前 ERα 靶基因的轉(zhuǎn)錄本積累，但也會(huì)導(dǎo)致許多不直接由 ERα 介導(dǎo)的次級(jí)轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。為了解決這些問(wèn)題，使用翻譯抑制劑環(huán)己酰亞胺定義雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的即時(shí)轉(zhuǎn)錄效應(yīng)的初步嘗試表明，只有 20%-30% 的表達(dá)變化基因是主要靶標(biāo)。然而，使用環(huán)己酰亞胺推斷主要雌激素靶基因是有問(wèn)題的，因?yàn)椋海?）環(huán)己酰亞胺不抑制非編碼調(diào)節(jié)RNA對(duì)基因表達(dá)的影響，而這些基因表達(dá)正被廣泛認(rèn)為是許多基因調(diào)控的重要機(jī)制；（2）穩(wěn)態(tài)mRNA的水平不僅取決于E2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，還取決于延伸率、pre-mRNA加工和mRNA降解率。 由于這些因素，顯然需要一種新的方法來(lái)最終鑒定主要的雌激素靶基因。

在這里，我們使用了全基因組核run-on 和測(cè)序（GRO-seq）以確定雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì) MCF-7 細(xì)胞中整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的直接影響。GRO-seq是一種直接測(cè)序方法，它以極高的分辨率提供基因組中所有參與的RNA聚合酶的位置和方向的“圖譜”，從而直接對(duì)轉(zhuǎn)錄測(cè)量。將 GRO-seq 與基于隱馬爾可夫模型 （HMM） 的生物信息學(xué)方法結(jié)合使用，我們確定了 MCF-7 細(xì)胞中由Pol Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ 轉(zhuǎn)錄的所有（即注釋和未注釋）基因組區(qū)域。此外，我們通過(guò)關(guān)注次要靶標(biāo)激活前的短期刺激（即 0、10 和 40 分鐘）來(lái)確定 E2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。我們獨(dú)特的方法揭示了E2 調(diào)節(jié)的許多意想不到的特征，提供了迄今為止對(duì) E2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要和直接影響的最全面的測(cè)量。我們的研究結(jié)果為理解其他系統(tǒng)中的快速信號(hào)依賴性轉(zhuǎn)錄提供了模型和資源。

1.?從雌激素處理的MCF-7細(xì)胞中生成GRO-Seq文庫(kù)

為了研究雌激素對(duì)人類細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的直接影響，我們用 17β-雌二醇 （estradiol，E2） 進(jìn)行短時(shí)（0、10、40 和 160 分鐘）處理雌激素剝奪的 ERα 陽(yáng)性 MCF-7 人乳腺癌細(xì)胞（圖 1A）。雌激素剝奪的MCF-7細(xì)胞繼續(xù)活躍生長(zhǎng)（圖S1A），細(xì)胞群在整個(gè)細(xì)胞周期中顯示出正態(tài)分布（圖S1B）。從經(jīng) E2 處理的 MCF-7 細(xì)胞的兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)中分離細(xì)胞核，并進(jìn)行 GRO-seq 以生成代表新生 RNA 的 ～100 bp 大小的文庫(kù)，并使用 Illumina 平臺(tái)對(duì)其進(jìn)行測(cè)序（圖 1A）。短讀長(zhǎng)與人類參考基因組（hg18、NCBI36）比對(duì)，包括常染色體、X 染色體和 rDNA 重復(fù)序列的一個(gè)完整拷貝（GenBank ID：U13369.1）。在每種處理?xiàng)l件下，大約有 1300 萬(wàn)至 1700 萬(wàn)個(gè)reads被唯一定位到基因組，并且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的生物學(xué)重復(fù)高度相關(guān)（平均相關(guān)系數(shù) = 0.98）（圖 S1C）。GRO-seq 包含來(lái)自所有三種 RNA 聚合酶（Pol Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ）的數(shù)據(jù)。為了驗(yàn)證與Pol Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ 轉(zhuǎn)錄的reads是否與每個(gè)單獨(dú)的RNA聚合酶的活性相關(guān)，我們進(jìn)行了聚合酶抑制劑組合的測(cè)定，以分離每種聚合酶的數(shù)據(jù)。正如預(yù)期的那樣，通過(guò)過(guò)濾器結(jié)合測(cè)定檢測(cè)到的活性與GRO-seq產(chǎn)物組分相當(dāng)，由于在重復(fù)rDNA序列中無(wú)法有效富集，GRO-seq對(duì)Pol Ⅰ轉(zhuǎn)錄本的組分略有低估（圖S1D）。

圖1B 上部顯示了LHX4 和ACBD6 基因位點(diǎn)的read counts 與基因組位置的代表性直方圖。 該圖說(shuō)明了數(shù)據(jù)的主要特征，包括鏈特異性轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）附近的發(fā)散轉(zhuǎn)錄以及某些基因（例如?LHX4）的穩(wěn)健性 E2 依賴性誘導(dǎo)。這些特征在同一區(qū)域的 ChIP-seq 數(shù)據(jù)中并不明顯（圖 1B 底部）。

2.?將GRO-Seq Reads無(wú)偏倚地分配給特定轉(zhuǎn)錄本

為了確定 E2 對(duì)整個(gè)轉(zhuǎn)錄組（即注釋和未注釋、編碼和非編碼）的影響，我們開發(fā)了一種使用雙模態(tài) HMM 調(diào)用轉(zhuǎn)錄本的無(wú)偏方法。該模型將整個(gè)基因組的 read counts 作為輸入信息，隨后將基因組分為代表“轉(zhuǎn)錄”和“非轉(zhuǎn)錄”區(qū)域的兩種狀態(tài)（圖1C插圖）。該算法對(duì)基因組基因富集區(qū)域的輸入和輸出示例如圖 1C 所示。圖 1C 頂部顯示GRO-seq數(shù)據(jù)的原始read counts，中間顯示預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄本，底部顯示RefSeq注釋。

為了評(píng)估該方法的穩(wěn)健性，我們將預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄本調(diào)用與現(xiàn)有注釋進(jìn)行了比較（有關(guān)詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱補(bǔ)充信息）。 首先，我們確定我們的預(yù)測(cè)是否反映了整個(gè)轉(zhuǎn)錄本，而不是將每個(gè)基因分解成一系列更小的單元。 然后，我們確定我們的方法是否能夠準(zhǔn)確識(shí)別相鄰但不同的基因注釋之間的非轉(zhuǎn)錄間隔。 我們發(fā)現(xiàn)，90%的轉(zhuǎn)錄注釋基因與一個(gè)轉(zhuǎn)錄本重疊，而82%的調(diào)用轉(zhuǎn)錄本與注釋基因重疊，恰好有一個(gè)注釋。總之，這些結(jié)果表明，我們基于 HMM 的轉(zhuǎn)錄調(diào)用在很大程度上概括了公共注釋。在許多情況下，與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中相比，我們的轉(zhuǎn)錄本調(diào)用提供了有關(guān) TSS、5′ 外顯子和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的新的或更精細(xì)的信息。使用我們的算法，我們?cè)?E2 刺激過(guò)程中的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)將基因組reads分配到 22,893 個(gè)轉(zhuǎn)錄本中，覆蓋了 ～27% 的 MCF-7 基因組。

HMM調(diào)用的轉(zhuǎn)錄本使用啟發(fā)式方法分為6 個(gè)不同的、不重疊的類，這些類描述了每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的最佳分類，給定當(dāng)前可用的注釋和其他信息（圖S1E和S1F）。我們定義的六類轉(zhuǎn)錄本如圖 1D 所示，包括：（1） 注釋的基因和非編碼 RNA 轉(zhuǎn)錄本，（2） 反義（基因）轉(zhuǎn)錄本，（3） 發(fā)散轉(zhuǎn)錄本，（4） ERα 增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄本，它們可能對(duì)應(yīng)于最近描述的增強(qiáng)子 RNA （Kim 等人，2010 ），（5）其他轉(zhuǎn)錄本落入注釋區(qū)域，但與注釋匹配不良，以及（6）完全未注釋的基因間轉(zhuǎn)錄。雖然每個(gè)轉(zhuǎn)錄本只分配給這六個(gè)類別中的一個(gè)，但在每個(gè)類別中，可以應(yīng)用多個(gè)注釋，從而可以準(zhǔn)確注釋屬于蛋白質(zhì)編碼基因內(nèi)含子內(nèi)的miRNA基因。我們發(fā)現(xiàn)，50.1% 的被調(diào)用轉(zhuǎn)錄本映射到先前注釋的基因或非編碼RNA，5.2% 映射到反義轉(zhuǎn)錄本，16.4% 映射到發(fā)散轉(zhuǎn)錄本，6.8% 映射到ERα結(jié)合增強(qiáng)子，12.1% 是完全未注釋的基因間轉(zhuǎn)錄本（圖1D）。

3.?廣泛的 MCF-7 轉(zhuǎn)錄組雌激素依賴性變化

我們使用最近描述的基于模型的方法確定了 22,893 個(gè)轉(zhuǎn)錄本中的哪一個(gè)響應(yīng) E2 而發(fā)生變化 （Robinson 等人，2010），該方法檢測(cè)超出全基因組變異水平的變化（圖S2A;詳見實(shí)驗(yàn)程序）。我們將分析重點(diǎn)放在每個(gè)轉(zhuǎn)錄本 5′ 端的 12 kb 窗口上，因?yàn)槲覀冾A(yù)計(jì)在此窗口的前 10 分鐘內(nèi)觀察到尚未擴(kuò)散到較長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的 3′ 端的變化。令人驚訝的是，我們意外發(fā)現(xiàn)MCF-7 轉(zhuǎn)錄組的大部分（～26%）的轉(zhuǎn)錄在 E2?處理后至少在時(shí)間過(guò)程中的一個(gè)點(diǎn)發(fā)生改變（相對(duì)于對(duì)照/未處理?xiàng)l件的上調(diào)或下調(diào)）（圖 2A;比較是相對(duì)于未處理的條件）。即使對(duì)于我們實(shí)驗(yàn)中使用的短期處理，基因組的大部分也受到調(diào)節(jié)，這強(qiáng)烈表明這些是ERα的直接作用。例如，在 E2 處理 10 分鐘時(shí)，近 10% 的 MCF-7 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組以 0.1% 的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率顯著變化（圖 2B）。另一個(gè)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)涉及上調(diào)和下調(diào)轉(zhuǎn)錄本的調(diào)控動(dòng)態(tài)。40 分鐘的 E2?處理是調(diào)控最多轉(zhuǎn)錄本的時(shí)間點(diǎn)，上調(diào)和下調(diào)的數(shù)量大致相等，但到 160 分鐘 時(shí) ～75% 的轉(zhuǎn)錄本下調(diào)（圖 2B）。這些轉(zhuǎn)錄本表明10 或 40 分鐘的調(diào)控代表了雌激素信號(hào)通路的直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)的最全面和最準(zhǔn)確的定義。

接下來(lái)，我們更詳細(xì)地研究了不同類別的信號(hào)。注釋的蛋白質(zhì)編碼和功能性 RNA 轉(zhuǎn)錄本作為一個(gè)類別，以及那些可能在基因調(diào)控中起作用的未注釋轉(zhuǎn)錄本類別（例如，發(fā)散和反義），在40分鐘時(shí)具有大致相等數(shù)量的上調(diào)和下調(diào)轉(zhuǎn)錄本（圖 2C 和 2D）。相比之下，ERα增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄本主要上調(diào)，而基因間轉(zhuǎn)錄本主要下調(diào)。總之，這些結(jié)果表明了一種協(xié)調(diào)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其中E2 信號(hào)將轉(zhuǎn)錄機(jī)制從基因間區(qū)域引導(dǎo)到對(duì)雌激素反應(yīng)更關(guān)鍵的區(qū)域。此外，它們對(duì)雌激素調(diào)節(jié)的基因表達(dá)給出了與使用表達(dá)微陣列獲得的根本不同的觀點(diǎn)，特別是在調(diào)節(jié)的時(shí)間、幅度和強(qiáng)度方面。

4.?雌激素對(duì)未注釋非編碼轉(zhuǎn)錄本的調(diào)節(jié)：發(fā)散、反義和基因間轉(zhuǎn)錄本

我們的GRO-seq 數(shù)據(jù)顯示，大量未注釋的非編碼轉(zhuǎn)錄本（包括發(fā)散、反義和基因間轉(zhuǎn)錄本）受到廣泛雌激素調(diào)節(jié)。盡管這些轉(zhuǎn)錄本的功能在很大程度上是未知的，但它們被E2 調(diào)控表明它們?cè)诖萍に匾蕾囆赞D(zhuǎn)錄反應(yīng)中發(fā)揮作用。最近的研究首次使用人類成纖維細(xì)胞（Core 等人，2008）和小鼠胚胎干細(xì)胞（Seila 等人，2008）的高通量全基因組測(cè)序方法記錄了發(fā)散轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生和積累。 發(fā)散轉(zhuǎn)錄本在基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子處以與主要轉(zhuǎn)錄本相反的方向轉(zhuǎn)錄，并且出現(xiàn)在增強(qiáng)子（比如eRNA）和其他轉(zhuǎn)錄的未注釋區(qū)域。發(fā)散轉(zhuǎn)錄本的功能尚不清楚，但已提出它們的產(chǎn)生通過(guò)產(chǎn)生無(wú)核小體區(qū)域或負(fù)超螺旋張力來(lái)促進(jìn)啟動(dòng)子處的開放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。 我們鑒定了 518 個(gè)與蛋白質(zhì)編碼基因的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他未注釋的轉(zhuǎn)錄區(qū)域相關(guān)的不同轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本至少在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)受 E2 調(diào)節(jié)（FDR q value < 0.001）。 我們假設(shè) E2 調(diào)控發(fā)散轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生與相應(yīng)主要轉(zhuǎn)錄本的合成相關(guān)。為此，我們測(cè)試了 844 個(gè)主要轉(zhuǎn)錄本/發(fā)散轉(zhuǎn)錄本配對(duì)，其中發(fā)散、主要或兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本至少在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)受到 E2 的調(diào)節(jié)。如圖S2B（左）所示，發(fā)散轉(zhuǎn)錄的E2依賴性變化與相應(yīng)主要轉(zhuǎn)錄本的E2依賴性變化密切相關(guān)（Pearson相關(guān)：0.744；p < 2.2×10e-16）。 這一結(jié)果與發(fā)散轉(zhuǎn)錄在促進(jìn)相應(yīng)主要轉(zhuǎn)錄本的 E2 依賴性轉(zhuǎn)錄中的作用一致。

雖然還沒(méi)有得到很好的表征，但反義轉(zhuǎn)錄已被證明在相應(yīng)正義轉(zhuǎn)錄本的降解以及染色質(zhì)水平的基因沉默中起作用。 在注釋為蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本的1197個(gè)反義轉(zhuǎn)錄本中，我們確定了 429 個(gè)受 E2 調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本（FDR q value <?0.001）（圖 S2C）。與發(fā)散轉(zhuǎn)錄本一樣，我們確定了 E2 調(diào)節(jié)的反義轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生是否與相應(yīng)主要轉(zhuǎn)錄本的合成相關(guān)?；?b>于582個(gè)正義/反義轉(zhuǎn)錄對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄與其反義轉(zhuǎn)錄本之間存在非常高的相關(guān)性（Pearson相關(guān)性：0.654；p < 2.2×10e-16）（圖S2B，右）。這尤其令人驚訝，因?yàn)榕c發(fā)散轉(zhuǎn)錄本不同，反義轉(zhuǎn)錄本不與正義轉(zhuǎn)錄本共享近端啟動(dòng)子，盡管通過(guò)基因組looping的啟動(dòng)子-啟動(dòng)子接觸可能允許協(xié)調(diào)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。如果反義轉(zhuǎn)錄本在正義轉(zhuǎn)錄本的降解中起作用，如前所述，那么它們的 E2 依賴性產(chǎn)生可能提供一種“內(nèi)置”手段來(lái)減弱一組選定的受雌激素調(diào)控轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)態(tài)水平。

我們還鑒定了 2761 個(gè)與先前基因組注釋沒(méi)有特定關(guān)系的轉(zhuǎn)錄本。其中，686 個(gè)至少在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)受到 E2 的影響。有趣的是，這些 E2 調(diào)節(jié)的基因間轉(zhuǎn)錄物中的絕大多數(shù)被 E2 處理下調(diào)（圖 2D）。這些轉(zhuǎn)錄本的功能尚不清楚。有些可能代表當(dāng)前未注釋的蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本或功能性 RNA。將功能歸因于這些RNA并確定它們?cè)诜€(wěn)態(tài)細(xì)胞RNA庫(kù)中的相對(duì)穩(wěn)定性將需要額外的研究。然而，它們被E2下調(diào)表明與雌激素信號(hào)傳導(dǎo)程序有關(guān)。 也許它們會(huì)拮抗 E2 依賴性轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并且必須關(guān)閉才能實(shí)現(xiàn)完整的雌激素反應(yīng)?；蛘?，如前所述，它們被 E2 拮抗可能是 RNA 聚合酶被轉(zhuǎn)移到雌激素信號(hào)通路的真正轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)的被動(dòng)作用。

5.?雌激素對(duì)蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本的快速、廣泛、瞬時(shí)調(diào)節(jié)

許多研究使用表達(dá)微陣列檢查了 E2 對(duì)蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。鑒于我們檢測(cè)短時(shí) E2 處理后即時(shí)轉(zhuǎn)錄變化的敏感性，我們查看了 GRO-seq 數(shù)據(jù)中的蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本。我們專注于RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋，因?yàn)樵摻M是最全面的轉(zhuǎn)錄本集合之一，并且與表達(dá)微陣列具有廣泛且有據(jù)可查的重疊。如上所述，我們?cè)诿總€(gè)注釋的 5′ 端的 12 kb 窗口中使用Read counts，并使用 edgeR 包確定 E2 的調(diào)控，以 0.1% 的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率過(guò)濾。

使用這種方法，我們總共檢測(cè)到 3098 個(gè)蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本，其水平在 E2 處理時(shí)間過(guò)程中的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)相對(duì)于對(duì)照（未處理）條件發(fā)生變化。總的來(lái)說(shuō)，這些轉(zhuǎn)錄本占 RefSeq 中注釋的所有基因的 ～15%（占 9337 個(gè)表達(dá)基因的 33%），這些基因?qū)?E2 有反應(yīng)。 這比之前使用表達(dá)微陣列在 E2 處理 1 或 3 小時(shí)檢測(cè)到的基因數(shù)量要多得多。 令人驚訝的是，我們發(fā)現(xiàn)總共有~1000 個(gè)基因在 E2 處理僅 10 分鐘后上調(diào)或下調(diào)。我們使用分層聚類來(lái)定義具有相似調(diào)控模式的四類基因，包括一類快速下調(diào)的基因和三類在三個(gè) E2 處理時(shí)間點(diǎn)（10、40 或 160 分鐘）具有最大轉(zhuǎn)錄的基因（圖 3A 和 3B）。下調(diào)類是最大的，占 E2 調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本的 ～50%。該類中的大多數(shù)基因迅速下調(diào)（平均10分鐘），并傾向于（除少數(shù)例外）在整個(gè)時(shí)間過(guò)程中保持下調(diào)。40 分鐘最大轉(zhuǎn)錄的上調(diào)基因是第二大類，占 E2 調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本的 ～34%。盡管四個(gè)類別的誘導(dǎo)或抑制時(shí)間過(guò)程不同，但不同類別之間的反應(yīng)幅度沒(méi)有差異（圖3C）。有趣的是，“10 分鐘最大”和“40 分鐘最大”類別中的基因平均在 E2 處理時(shí)間過(guò)程結(jié)束時(shí)恢復(fù)到基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平（圖 3B），突出了大多數(shù)上調(diào)基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的快速和瞬時(shí)性質(zhì)。

在大多數(shù)情況下，轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)相關(guān)變化應(yīng)伴隨著相應(yīng) mRNA 穩(wěn)態(tài)水平的類似變化。我們使用基因組和基因特異性比較來(lái)驗(yàn)證這一假設(shè)。首先，我們比較了使用GRO-seq數(shù)據(jù)檢測(cè)到的主要轉(zhuǎn)錄的倍數(shù)變化，以及從已發(fā)表的 MCF-7 細(xì)胞表達(dá)微陣列數(shù)據(jù)中檢測(cè)到的穩(wěn)態(tài) mRNA 水平的倍數(shù)變化（E2 處理 3 或 12 小時(shí)）。對(duì)于我們觀察到的受GRO-seq調(diào)控的基因子集，我們發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的相關(guān)性是40或160分鐘的GRO-seq時(shí)間點(diǎn)與3小時(shí)的微陣列時(shí)間點(diǎn)（圖S3B和S3C）。然而，請(qǐng)注意，與通過(guò)表達(dá)微陣列分析相比，我們檢測(cè)到的E2調(diào)控基因要更多（圖S3A）。如果我們將分析限制于在微陣列分析中發(fā)生變化的基因（FDR校正q value < 0.05），我們會(huì)看到GRO-seq和微陣列數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性更高（圖3D；斯皮爾曼相關(guān)性：0.75）。該分析表明，E2的早期作用幾乎都是在轉(zhuǎn)錄水平上介導(dǎo)的，并且E2不直接影響RNA的穩(wěn)定性或降解率。這些結(jié)果首次表明，由GRO-seq確定的轉(zhuǎn)錄會(huì)傳播到相應(yīng)mRNA穩(wěn)態(tài)水平的變化。

接下來(lái)，我們隨機(jī)從四類中的每類中選擇了10 到 20 個(gè)基因（總共 54 個(gè)基因），使用RT-qPCR 測(cè)量每個(gè)基因在 E2?處理的 6 小時(shí)時(shí)間過(guò)程中的相對(duì)穩(wěn)態(tài)水平。一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)GRO-seq測(cè)量的轉(zhuǎn)錄變化反映在通過(guò)RT-qPCR測(cè)量的穩(wěn)態(tài)mRNA水平的相應(yīng)變化中（圖3E和圖S4）。在幾乎所有檢測(cè)中，我們觀察到通過(guò)GRO-seq和RT-qPCR測(cè)量的峰倍數(shù)變化之間有～1-3小時(shí)的延遲，該延遲反映了Pol?Ⅱ 到達(dá)基因3′ 端的過(guò)程以及mRNA 達(dá)到可檢測(cè)水平積累（或降解）所需的時(shí)間。 與微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)的比較一樣，這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄的變化被有效地轉(zhuǎn)化為相應(yīng)mRNA的穩(wěn)態(tài)水平的變化。下調(diào)和40 分鐘達(dá)到最大值的GRO-seq 類別之間對(duì)應(yīng)關(guān)系最強(qiáng)（>80% 的檢測(cè)基因顯示出相應(yīng)的變化），而10 分鐘達(dá)到最大值和160 分鐘達(dá)到最大值的類別之間對(duì)應(yīng)關(guān)系較弱（～50% 的檢測(cè)基因顯示相應(yīng)變化）。轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)態(tài) mRNA 水平之間的差異可能是由于某些新生轉(zhuǎn)錄本固有的不穩(wěn)定性，這阻止了它們產(chǎn)生成熟的轉(zhuǎn)錄本?；蛘?，它們可能反映出特定轉(zhuǎn)錄本的活躍轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（例如通過(guò)miRNA；見下文）。有趣的是，我們?yōu)槊總€(gè) GRO-seq 時(shí)間點(diǎn)鑒定了許多示例基因，其中轉(zhuǎn)錄的 E2 依賴性變化伴隨著同源蛋白水平的相應(yīng)變化，包括 10 分鐘達(dá)到最大值的類別（例如KRT19、MYC 和 VDR；圖 S3D 和 S3E）。

對(duì)四類基因的基因術(shù)語(yǔ)目錄（GO）分析揭示了下調(diào)和40 分鐘達(dá)到最大值類別的基因功能具有相似富集模式（表S1A和S1C），這與先前從微陣列表達(dá)分析的有差異/更加豐富。具體而言，與轉(zhuǎn)錄、核酸代謝、細(xì)胞表面受體和 G 蛋白偶聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的 GO 術(shù)語(yǔ)有顯著富集。相同的 GO 術(shù)語(yǔ)但不同的基因既分布在上調(diào)類別也分布在下調(diào)類別中，這一事實(shí)表明從一種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)程序（例如血清反應(yīng)）切換到另一種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)程序（即雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)）時(shí)候，每個(gè)途徑可能都需要具有相同功能類別的基因，但使用的是每個(gè)類別中的一組不同基因。有趣的是，160 min 到達(dá)最高值的GO術(shù)語(yǔ)顯著富集了與核糖體生物發(fā)生、翻譯和蛋白質(zhì)合成相關(guān)的GO術(shù)語(yǔ)（如下所述）（表S1 D），而10?min 到達(dá)最高值的GO術(shù)語(yǔ)富集非常寬泛（表S1B）。

總之，我們的結(jié)果表明，蛋白質(zhì)編碼基因（以及其他類別的轉(zhuǎn)錄本；見下文）對(duì)雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是快速、廣泛和短暫的。這代表了與微陣列表達(dá)研究提供的雌激素反應(yīng)所不同的觀點(diǎn)，微陣列表達(dá)研究表明，對(duì)E2處理的反應(yīng)是一組不斷增加的被調(diào)控基因，這其中許多可能是二級(jí)或三級(jí)效應(yīng)（圖S3A）。

6.?Pol Ⅱ 響應(yīng)E2 的動(dòng)力學(xué)

由于蛋白質(zhì)編碼基因?qū)Υ萍に匦盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是快速且短暫的，因此我們探索了 Pol Ⅱ 在四類分組的啟動(dòng)子上的動(dòng)力學(xué)。對(duì)于每個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)，我們?cè)诿款惖膯?dòng)子區(qū)域進(jìn)行了宏基因分析，范圍從-4 kb到+4 kb（圖4A）。緊鄰 TSS 的peaks 表明在 E2處理前后都存在參與動(dòng)態(tài)變化的 Pol Ⅱ。 下游區(qū)域reads 的減少（或增加）表明轉(zhuǎn)錄響應(yīng) E2 的下調(diào)（或上調(diào)）。GRO-seq的結(jié)果突出強(qiáng)調(diào)了以下幾點(diǎn)：平均而言，（1）Pol Ⅱ 在上調(diào)基因的TSS上的負(fù)載會(huì)在E2處理下增加，（2）上調(diào)基因的發(fā)散轉(zhuǎn)錄在E2處理下增加，（3）下調(diào)主要影響基因體中的Pol Ⅱ，（4）Pol Ⅱ在TSS上的加載和發(fā)散轉(zhuǎn)錄主要遵循基因體內(nèi)的Pol Ⅱ反應(yīng)。

響應(yīng) E2 時(shí) TSS 處 Pol Ⅱ 負(fù)載的增加表明，對(duì)于這些類別的 E2 調(diào)節(jié)基因，Pol Ⅱ 的負(fù)載速度比逃逸到基因體內(nèi)的速度更快。這在 40 分鐘達(dá)到最大值類別的 10 與 40 分鐘時(shí)間點(diǎn)之間以及 160 分鐘達(dá)到最大值類別的 40 和 160 分鐘時(shí)間點(diǎn)之間尤為明顯，我們看到早期時(shí)間點(diǎn)的 Pol Ⅱ 負(fù)載增加，隨后在較晚的時(shí)間點(diǎn)基因體內(nèi)的 Pol Ⅱ 明顯增加。這種“延遲” 的加載和逃逸模式對(duì)于 160 分鐘達(dá)到最大值的基因來(lái)說(shuō)可能是出乎意料的，因?yàn)?Pol Ⅱ 在啟動(dòng)子近端區(qū)域的暫停被認(rèn)為允許快速激活轉(zhuǎn)錄以響應(yīng)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)；或者，這種反應(yīng)與最近的發(fā)現(xiàn)非常吻合，即在啟動(dòng)子近端區(qū)域暫停Pol?Ⅱ 允許同步基因激活（Boettiger & Levine，2009）。

Pol Ⅱ 的動(dòng)力學(xué)也可以在特定上調(diào)和下調(diào)基因的例子中清楚地觀察到（圖4B和4C以及圖S4）。響應(yīng) E2 上調(diào)的基因，觀察到 Pol Ⅱ 波的前緣在 E2 處理后進(jìn)入基因體（圖 4B）。相反，響應(yīng)E2 下調(diào)的基因，當(dāng)聚合酶從TSS中移除時(shí)，觀察到Pol Ⅱ 波的滯后邊緣（圖4C）。我們的GRO-seq分析結(jié)果為Pol Ⅱ 響應(yīng)持續(xù)信號(hào)的動(dòng)力學(xué)提供了前所未有的視角。

7.?雌激素對(duì)miRNA基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控：與蛋白質(zhì)編碼基因的調(diào)控相似

我們的GRO-seq方法還提供了主要的microRNA 轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄調(diào)控的大量信息。MicroRNAs （miRNAs） 是 ～22?nt 的非編碼調(diào)節(jié) RNA，通過(guò)抑制靶標(biāo) mRNAs 的翻譯或促進(jìn)降解來(lái)介導(dǎo)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miRNA 前體轉(zhuǎn)錄本 （pri-miRNAs） 由?Pol Ⅱ 產(chǎn)生，或者在某些情況下由 Pol Ⅲ 產(chǎn)生，作為嵌入它們的“宿主”基因的一部分，或者使用它們自己的啟動(dòng)子從基因間區(qū)域產(chǎn)生。 使用我們的 GRO-seq 數(shù)據(jù)集，我們探索了 E2 對(duì) pri-miRNAs 基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。我們根據(jù)miRBase?Ver. 14 在我們的數(shù)據(jù)集中明確鑒定了 322 個(gè)表達(dá)的含 miRNA 的轉(zhuǎn)錄本。其中，119 （～37%） 在至少一個(gè)時(shí)間點(diǎn)（FDR q value < 0.001）受 E2 調(diào)節(jié)。 受調(diào)控的 pri-miRNA 包括一些先前發(fā)表的雌激素受控 miRNA，包括 mir-181a、mir-181b 和 mir-21。 整體來(lái)看，圖 5 A 所示熱圖中描繪的調(diào)控模式很像從蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本中觀察到的（即大約一半上調(diào)和一半下調(diào)）。 幾個(gè)pri-miRNAs的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)示例如圖5B所示。兩個(gè)示例的主要轉(zhuǎn)錄本都比處理后的miRNA大得多。因此，與蛋白質(zhì)編碼基因一樣，在上調(diào)（或下調(diào)）基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過(guò)程中可以看到聚合酶波的前（或滯后）邊緣。總之，這些結(jié)果表明，pri-miRNA基因的轉(zhuǎn)錄以與蛋白質(zhì)編碼基因相似的模式和相似的動(dòng)力學(xué)受 E2 調(diào)控。

接下來(lái)，我們確定雌激素刺激是否涉及pri-miRNA轉(zhuǎn)錄本與它們最終調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)編碼基因之間的協(xié)調(diào)反應(yīng)。 對(duì)于這項(xiàng)分析，我們推斷，經(jīng)歷長(zhǎng)期和相對(duì)較大的調(diào)控變化的 pri-miRNAs 亞群最有可能反映為被加工的成熟 miRNA 的變化。因此，我們專注于 119 個(gè)受調(diào)節(jié)的 pri-miRNAs 轉(zhuǎn)錄本中的 47 個(gè)（～40%），這些轉(zhuǎn)錄本顯示出超過(guò) 3 倍的上調(diào)或下調(diào)。根據(jù) TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)，這 47 種穩(wěn)健的、受 E2 調(diào)控的 pri-miRNAs 可能靶向 ～2700 個(gè) mRNAs，或 ～12.8% 的 RefSeq 中注釋的 mRNAs。

有趣的是，如圖 5C 所示，在MCF-7 細(xì)胞中作為靶標(biāo) mRNAs的表達(dá)比例比預(yù)期的要大，因此 16.6% 的表達(dá)基因是這些 miRNA 的靶標(biāo)。 重要的是，E2調(diào)控的基因亞群比細(xì)胞表達(dá)的基因進(jìn)一步富集，18.6%的E2調(diào)控mRNAs 是E2 調(diào)控的pri-miRNAs的靶標(biāo)（p = 0.03）（圖5C）。 此外，當(dāng)選擇一組較小的miRNAs時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了這種富集模式，這些miRNA受超過(guò)5倍的E2調(diào)節(jié)（p = 0.02），或者取所有miRNA轉(zhuǎn)錄本（p = 0.02），表明無(wú)論其倍數(shù)變化如何，我們的結(jié)果對(duì)選擇的閾值是穩(wěn)健的。我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何證據(jù)表明 E2 特異性地協(xié)調(diào) pri-miRNA 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與其潛在靶標(biāo) mRNA 的調(diào)控方向（即向上或向下），無(wú)論是通過(guò) GRO-seq（圖5 D，中）還是通過(guò)表達(dá)微陣列（圖 5D，右）。事實(shí)上，我們發(fā)現(xiàn)了協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)和補(bǔ)償調(diào)節(jié)的證據(jù)（圖5D；詳見圖S5）?？傊@些結(jié)果表明，對(duì)于pri-miRNA轉(zhuǎn)錄本和成熟miRNA靶向的mRNAs的E2調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，存在一個(gè)綜合調(diào)控程序。

8.?雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)蛋白質(zhì)生物合成機(jī)制的顯著上調(diào)

由于我們的GO分析顯示，在蛋白質(zhì)生物合成中具有主要生物學(xué)功能的基因富集，因此我們探索了E2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是否對(duì)蛋白質(zhì)生物合成機(jī)制具有更廣泛的影響。GRO-seq提供了所有三種真核聚合酶的測(cè)量； 因此，我們提取并分析了UCSC基因組瀏覽器中rnaGene?track 中注釋的45S rRNA（RNA Pol Ⅰ）和tRNA（Pol Ⅲ）的變化數(shù)據(jù)。我們的分析表明，Pol Ⅰ 和 Pol Ⅲ 轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄顯示出 E2 的類似調(diào)節(jié)模式：（1） 10 分鐘時(shí)的初始爆發(fā)，（2） 40 分鐘時(shí)略有減少，（3） 160 分鐘時(shí)最大（圖 6A 和 6D）。這種快速效應(yīng)表明其對(duì)雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是主要的，而不是次要的。

對(duì)于單個(gè)tRNA基因，變化強(qiáng)烈偏向于上調(diào)，>90%的tRNA基因的轉(zhuǎn)錄顯示上調(diào)（圖6B）。此外，該調(diào)控在至少一個(gè)時(shí)間點(diǎn)明確影響 486 個(gè)功能注釋的 tRNA 基因中的 158 個(gè)（32%）。如果細(xì)胞確實(shí)在調(diào)節(jié)tRNA基因以促進(jìn)翻譯的增加，那么人們可能會(huì)期望所有20個(gè)氨基酸都會(huì)上調(diào)。事實(shí)上，我們發(fā)現(xiàn)，在 158 個(gè)上調(diào)的 tRNA 基因中，至少有一個(gè)編碼 20 種氨基酸中一個(gè)的 tRNA 基因 （p = 0.0012）（圖S6A）。 除了 20 種主要氨基酸外，我們還發(fā)現(xiàn)了編碼氨基酸變體硒代半胱氨酸的 tRNA，它被認(rèn)為在抗氧化活性和激素生物合成中發(fā)揮作用，也受到 E2 調(diào)控。 由于每三個(gè)字母的密碼子組合在 486 個(gè)注釋的 tRNA 基因中多次出現(xiàn)，我們還詢問(wèn)了 E2 是否調(diào)節(jié)了 64 種可能的密碼子組合比預(yù)期的更大比例。 事實(shí)上，我們發(fā)現(xiàn) 64 個(gè)密碼子組合中有 64% 受到 E2 的明確調(diào)控，這超出了我們陳述的 32% 的 tRNA 基因受調(diào)控的預(yù)期（p = 0.0027）。這些結(jié)果表明，在蛋白質(zhì)生物合成機(jī)制中觀察到的變化以穩(wěn)健和協(xié)調(diào)的方式應(yīng)用于氨基酸和密碼子變異。

我們還對(duì)具有功能或細(xì)胞定位的蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行了更集中的分析，這些基因在蛋白質(zhì)生物合成中起作用（例如，核糖體生物發(fā)生、tRNA 氨基乙?；龋凰惺褂玫?GO 術(shù)語(yǔ)參見圖 S6B）。 正如我們觀察到的tRNA基因，這些代表性的蛋白質(zhì)編碼基因強(qiáng)烈偏向于上調(diào)（圖6C）。 如上述 GO 分析所表明，這些基因在 160 分鐘達(dá)到最大值的類別中強(qiáng)烈富集（p = 6.7 × 10e-13），表明這些是將細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中觀察到的廣泛變化轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)組的持續(xù)效應(yīng)。

綜上所述，這些結(jié)果表明雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)蛋白質(zhì)生物合成機(jī)制具有有效作用，這與已知的 E2 對(duì) MCF-7 細(xì)胞的促有絲分裂作用非常吻合。此外，他們還強(qiáng)調(diào)了這樣一個(gè)事實(shí)，即雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)所有三種RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)具有強(qiáng)烈、直接和可能的直接影響，而不僅僅是Pol Ⅱ。 蛋白質(zhì)生物合成機(jī)制的上調(diào)可能是雌激素信號(hào)通路為細(xì)胞準(zhǔn)備翻譯蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本的一種方式，這些轉(zhuǎn)錄本是響應(yīng)雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而新合成的。

9.?ERα 結(jié)合位點(diǎn)與主要的雌激素靶基因的關(guān)系

盡管大多數(shù) ERα 結(jié)合位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)編碼基因啟動(dòng)子的遠(yuǎn)端，但在上調(diào)基因的近端啟動(dòng)子中也觀察到 ERα 結(jié)合位點(diǎn)的小而顯著富集（Carroll 等人，2005，Carroll 等人，2006），與ERα在介導(dǎo)其調(diào)節(jié)中的直接作用一致。 由于我們的GRO-seq數(shù)據(jù)反映了細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)錄輸出，并且由于我們較短的處理時(shí)間使我們不太可能檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄的繼發(fā)性變化，因此我們認(rèn)為我們應(yīng)該觀察到受GRO-seq調(diào)控的基因中有很大一部分位于ERα結(jié)合位點(diǎn)附近。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們使用了現(xiàn)有的ERα?ChIP-seq 數(shù)據(jù) （Welboren 等，2009）以確定具有近端 ERα 結(jié)合位點(diǎn)（距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) < 10 kb）的 E2 調(diào)節(jié)的 RefSeq 基因的比例。 事實(shí)上，我們發(fā)現(xiàn)46%的基因在較短的時(shí)間點(diǎn)（即 10 分鐘和 40 分鐘）被 E2 上調(diào)，在其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 10 kb 內(nèi)含有一個(gè) ERα 結(jié)合位點(diǎn)。

有趣的是，當(dāng)我們分別分析四類 RefSeq 基因（即 10、40、160 分鐘達(dá)到最大值和下調(diào)的）時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)這些類別之間的結(jié)合位點(diǎn)富集存在顯著差異（圖 7A）。 特別是，在40分鐘達(dá)到最大值的類別中，幾乎一半的基因位于ERα結(jié)合位點(diǎn)的10 kb范圍內(nèi)，這遠(yuǎn)高于一般RefSeq基因的 ～10% 富集率（p < 2.2 × 10e-16）。10 分鐘達(dá)到最大值類基因的近端 ERα 結(jié)合位點(diǎn)也大量富集 （33%，p = 1.2 × 10e-12)。 在160分鐘后達(dá)到最大值的上調(diào)基因具有較低的富集水平，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（12%，p = 0.24），這表明該基因子集的很大一部分反映了次要效應(yīng)。 相反，下調(diào)基因位于ERα結(jié)合位點(diǎn)10 kb以內(nèi)的可能性略低于平均水平（8%，p = 0.01）。 這一觀察結(jié)果強(qiáng)烈表明，E2 通過(guò)不同的機(jī)制介導(dǎo)上調(diào)和下調(diào)，并且立即上調(diào)的基因往往是 ERα 的直接基因組靶標(biāo)。那些沒(méi)有近端 ERα 結(jié)合位點(diǎn)的 E2 調(diào)節(jié)基因可能受 （1） 其他啟動(dòng)子近端結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子 或 （2） 從遠(yuǎn)端 ERα 增強(qiáng)子到啟動(dòng)子的 looping 調(diào)節(jié)。

更廣泛地觀察轉(zhuǎn)錄本類別，我們發(fā)現(xiàn)在 E2 處理 40 分鐘時(shí)定義的集合顯示出比其他時(shí)間點(diǎn)定義的集合更豐富的 ERα 結(jié)合位點(diǎn)和 EREs 的富集。有趣的是，雖然與所有 RefSeq 轉(zhuǎn)錄本相比，在生物信息學(xué)定義的?EREs 附近啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄本百分比并沒(méi)有大大富集，并且在轉(zhuǎn)錄本類別中相對(duì)恒定（即 ～30%–50%），但在實(shí)驗(yàn)定義的 ERα 結(jié)合位點(diǎn)附近啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄本百分比差異很大（圖 7B）。 與所有 RefSeq 相比，我們觀察到 ERα 結(jié)合位點(diǎn)靠近注釋、反義、發(fā)散和增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄本的起始位點(diǎn)時(shí)有最大富集，這表明 E2 依賴性調(diào)控模式與蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本相似（圖 7B）。

接下來(lái)，我們確定了GRO-seq 分析中定義的每類轉(zhuǎn)錄本在近端啟動(dòng)子 （<1 kb） 內(nèi)映射的所有 ERα 結(jié)合位點(diǎn)的比例（即，從 ERα 結(jié)合位點(diǎn)為中心的視圖，而不是上面以轉(zhuǎn)錄本為中心的視圖）。 我們發(fā)現(xiàn)，在MCF-7 細(xì)胞中使用我們的HMM 檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本中，有18% 的ERα結(jié)合位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄本附近（圖7C）。這包括使用我們的方法特異性發(fā)現(xiàn)在 MCF-7 細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本附近 ～5%–6% 的 ERα 結(jié)合位點(diǎn)（圖 7C，橙色條），以及在產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄本的基因的近端啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的另外 ～12% 的 ERα 結(jié)合位點(diǎn)，這些基因目前未在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋（即 反義、發(fā)散和增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄本）。盡管這一發(fā)現(xiàn)仍然表明長(zhǎng)程增強(qiáng)子-啟動(dòng)子相互作用在 ERα 的作用中起著關(guān)鍵作用，但它同時(shí)表明位于 TSSs 附近的 ERα 結(jié)合位點(diǎn)的比例增加了 3 到 4 倍。

綜上所述，我們的研究結(jié)果為信號(hào)依賴性轉(zhuǎn)錄事件提供了新的觀點(diǎn)，提出了關(guān)于轉(zhuǎn)錄反應(yīng)特定方面的新問(wèn)題和新思維方式。

Hah N, Danko CG, Core L, Waterfall JJ, Siepel A, Lis JT, Kraus WL. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 2011 May 13;145(4):622-34.?