1. Author
James E. Crowe Jr美國著名的免疫學家和病毒學家，以其在傳染病，尤其是新興病毒領域的抗體研究和疫苗開發(fā)方面的開創(chuàng)性工作而享譽全球?，F任美國范德比爾特大學醫(yī)學院?兒科教授、病理學、微生物學和免疫學教授，范德比爾特疫苗中心（VVC）?主任。James E. Crowe Jr不僅是一位頂尖的科學家，還是一位積極推動科研成果轉化的企業(yè)家。他是IDBiologics公司的聯合創(chuàng)始人，該公司致力于將其實驗室發(fā)現的人源單克隆抗體開發(fā)成臨床應用的治療藥物。James E. Crowe Jr的研究核心是理解人體如何產生高效的中和抗體來對抗病毒，并利用這一知識開發(fā)新型療法和疫苗。他的成就主要體現在以下幾個方向：
Jr實驗室最著名的貢獻。他們的研究方法非常高效：從感染后康復或接種疫苗后的個體中快速分離出產生抗體的B細胞，然后克隆出這些抗體并進行大量測試。寨卡病毒（Zika virus）：?他的團隊在疫情爆發(fā)后極短的時間內，就從康復者體內分離出了強效的中和抗體，為治療和預防提供了重要的候選藥物，并幫助理解了免疫保護機制。除此以外James E. Crowe Jr實驗室還分離得到其他病原的強效中和抗體：登革熱病毒（Dengue virus）、西尼羅河病毒（West Nile virus）、埃博拉病毒（Ebola virus）、呼吸道合胞病毒（RSV）、諾如病毒（Norovirus）、漢坦病毒（Hantavirus）、新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）。
James E. Crowe Jr的工作反向推動了疫苗學的發(fā)展。通過分析最優(yōu)質抗體所識別的病毒位點（即抗原表位），可以為理性疫苗設計提供精確的藍圖，指導科學家設計出能更有效激發(fā)此類保護性抗體的疫苗。他的研究深入揭示了人體對自然感染和疫苗接種產生抗體反應的規(guī)律和差異。James E. Crowe Jr建立了一套世界領先的、快速響應的抗發(fā)現平臺。這套“從患者到抗體”的流程化技術使其能夠在任何一種新發(fā)傳染病出現時，迅速啟動研究，在數月甚至數周內篩選出有治療潛力的候選抗體，為應對未來的流行病威脅做好了技術儲備。
2.Background
2.1 EBV（Epstein-Barr Virus）永生化B淋巴細胞
這是一種經典的體外制備人源單克隆抗體的技術，尤其適用于直接利用人源B細胞生產抗體，避免了鼠源抗體的免疫原性問題。EBV永生化技術的核心在于EB病毒（人類皰疹病毒第四型HHV-4）?能夠特異性地感染人類B淋巴細胞，并將其轉化為能夠無限增殖的淋巴母細胞樣細胞系。
其分子生物學原理主要涉及病毒蛋白和基因組的作用：1.病毒靶向性：EBV通過其病毒糖蛋白gp350與B細胞表面的CD21分子（也是補體C3d的受體）?結合，從而特異性地感染B細胞。2. 永生化（轉化）的關鍵：病毒進入細胞后，其環(huán)形DNA基因組（稱為附加體Episome）會留在細胞核內，但并不整合到宿主染色體上。病毒會表達一組特定的潛伏期基因，其中最關鍵的是潛伏膜蛋白1（LMP1）?和核抗原（EBNA2， EBNA1等）。LMP1： 模擬B細胞激活因子CD40的組成型激活信號，持續(xù)提供B細胞增殖和存活信號，抑制細胞凋亡。EBNA2： 作為轉錄激活因子，上調宿主細胞和病毒自身多種促增殖基因（如c-Myc）和抗凋亡基因的表達。這些病毒蛋白共同作用，劫持了B細胞的正常調控通路，使其擺脫衰老和凋亡的命運，獲得永生性（Immortalization），能夠在體外持續(xù)分裂和培養(yǎng)。3. 抗體的產生：被EBV轉化的B細胞保留了其作為B細胞的核心功能，即分泌免疫球蛋白（抗體）。如果一個B細胞在被病毒感染前，已經因為某種抗原刺激而分化為分泌特定抗體的漿母細胞/漿細胞，那么它被永生化后，就會持續(xù)分泌同一種特異性抗體，從而建立起一個分泌單克隆抗體的細胞系。
3. Methods
1. 雜交瘤技術與抗體純化
2.?B細胞分析
3.?HA蛋白純化表達
4.?抗體序列測序
5.?中和實驗
6.?BLI競爭實驗
7.?晶體X射線衍射技術
8.?動物實驗
4. Results
實驗團隊將接種A/shanghai/02/2013疫苗的75名受試者作為研究隊列，采集外周血后利用EBV技術得到對應抗體進行功能驗證。在75名受試者中27名顯示出對H7 HA的結合，2名受試者的頻率遠高于其他人——0.33％和0.75％。值得注意的是，在疫苗接種之前，H7反應性B細胞頻率最高的供體H7反應B細胞頻率為0.75％H7反應B細胞，但疫苗接種后僅有0.66％。選擇了五個代表性受試者來篩選針對Group1和Group2的HA的反應性。分別是185、190、198、208、233號。最常見的交叉結合模式是H7-H3交叉反應性。對于185、190和233號來說，它們最常見的B細胞反應性是H3。 其他2個受試者（198和208）對H1具有最常見的B細胞反應性。 因此，盡管是H7疫苗接種者，但都表現出H1或H3反應性。
實驗團隊從12個受試者中挑選了20個mAb，11個的EC50值低于1μg/ml。H7.57，H7.169和H7.134均在ng/mL范圍內顯示出EC50值。在12個mAb中，濃度低于2μg/ml的HAI活性。所有5個具有HAI活性的mAb均具有對A/02/2013 H7N9疫苗菌株的活性，H7.167表現出特別有效的抑制作用，具有半最大的抑制濃度（IC50）為31 ng/ml。 所有5個具有HAI活性的mAb也抑制了對歐亞譜系H7N9和H7N3病毒以及北美H7N3病毒的活性。H7.96抗體表現出A/Sydney/5/1997（H3N2）的有效中和活性，即使它沒有針對H7的 HAI活性——這表明它可能是從先前H3暴露引起的記憶B細胞中得出的。
緊接著實驗團隊檢測了11株抗體的交叉反應性。其中5個抗體（H7.169, H7.137, H7.57, H7.167和H7.5）僅結合H7的HA，其中H7.5結合H7的3中亞型。H7.134和H7.105結合絕大多數Group2的流感HA，而H7.96結合Group1與Group2。
實驗團隊后續(xù)利用表位競爭實驗與X射線晶體衍射技術，解析了相應抗體的結合位點。H7.92在受體結合口袋附近結合，但不能抑制病毒受體相互作用。H7.3和H7.105在低于2μg/ml的濃度下沒有表現出HAI活性。它們在不與受體結合口袋附近的區(qū)域結合。mAb H7.167是具有最強的HAI活性，在壓力選擇下產生了兩個點突變——N157D / N158bD。當將受體類似物與H7 HA的RBS反應時，重鏈的可變區(qū)顯示出明顯的位阻。H7.167通過一系列氫鍵和范德華相互作用靶向H7的高度保守的表位。重鏈的結合殘基位于150 loop、130 loop和190螺旋附近的R131、N157、N158；輕鏈結合位點則遠離RBS的F161、S187、K200和N248。
實驗團隊直接比較具有或沒有HAI活性的H7反應性mAb的可變基因中的突變頻率，展現出顯著差異。發(fā)現H7特異性mAB的突變明顯低于H1特異性；其次突細胞突變的頻率為：H7異源反應＞廣譜中和＞H1特異性＞H5特異性＞H7特異性。
5. Discussion
作者：Natalie J. Thornburg
通訊作者：James E. Crowe Jr
單位：The Vanderbilt Vaccine Center and Department of Pediatrics,Vanderbilt University, Nashville, Tennessee, USA.
年份：2016.01.21
期刊：JCI
科學問題：在H7N9疫苗接種者體內特異性抗體情況
討論：實驗團隊以疫苗接種者作為研究隊列，篩選得到了中和活性低至16 ng/ml的H7.167。
這種抗體具有預防性或治療性生物學藥物潛能，用于治療H7病毒暴露或感染。事實上在未經歷高劑量蛋白免疫或者佐劑輔助的情況下，誘導強效中和抗體十分困難。 目前，尚不清楚HA分子是否具有與禽類宿主相關的抗原特征，以至于他們缺乏人類相關的免疫原性。此處報道的工作表明，H7亞單位疫苗接種以后可以產生擁有一定集結合能力的B細胞。通過后續(xù)表位相關實驗表明：H7.167主要作用區(qū)域為頭部的130，150-loop以及190螺旋，此外157與158兩個位點的氨基酸與150 loop的相互作用十分特殊，與其特異性相關。實驗團隊同時比較了不同特異性的抗體的體細胞突變頻率，發(fā)現H7反應性的克隆突變數為2-23。相對的H1甚至H5的抗體突變數相對較高——平均突變數為18和12。有趣的是，人體理論上第一次接觸H7抗原，但是產生的抗體卻普遍具體交叉反應性。這些克隆具體顯著的體細胞突變，這表明它們是由先前的H3或其他季節(jié)性HA暴露引起的記憶B細胞引起的。H7.96對Group1與Group2的HA具有廣泛的反應性，該抗體能夠中和H3N2但是不能夠中和H7N9。
之前有文獻報道指出，當抗原攜帶R131G突變以后會降低結合能力。本研究鑒定的三株抗體：H7.57，H7.137和H7.169與該位點結合。在壓力選擇下，毒株產生的S132L或 A138D都位于該位點附近。這三個抗體的HAI活性都較為客觀，位于0.1至1μg/ml范圍內。值得一提的是，所有鑒定的抗體對HA的V186G和L226Q敏感，會顯著影響CDR3的結合。
