一、lncRNA的研究背景
表觀遺傳學(xué)是研究基因表達(dá)發(fā)生了可遺傳的改變，而DNA序列不發(fā)生改變的一門(mén)生物學(xué)分支，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化及腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。表觀遺傳學(xué)的主要機(jī)制包括DNA甲基化、組蛋白修飾及新近發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA。非編碼RNA是指不能翻譯為蛋白的功能性RNA分子，其中常見(jiàn)的具調(diào)控作用的非編碼RNA包括小干涉RNA、miRNA、piRNA以及長(zhǎng)鏈非編碼RNA。研究者的大量研究表明非編碼RNA在表觀遺傳學(xué)的調(diào)控中扮演了越來(lái)越重要的角色。
在近十余年的生命科學(xué)研究中非編碼調(diào)控RNA可謂是研究最火的領(lǐng)域之一，從2006年諾獎(jiǎng)的siRNA，到這幾年異常火爆的microRNA，到即將登場(chǎng)并定能風(fēng)靡的lncRNA，可謂如火如荼。RNA不僅僅只承擔(dān)遺傳信息中間載體的輔助性角色，而是更多地承擔(dān)了各種調(diào)控功能。
lncRNA在發(fā)育和基因表達(dá)中發(fā)揮的復(fù)雜精確的調(diào)控功能極大地解釋了基因組復(fù)雜性之難題，同時(shí)也為人們從基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的維度來(lái)認(rèn)識(shí)生命體的復(fù)雜性開(kāi)啟新的天地。研究者大部分研究集中于短?RNA如?microRNA，piRNA?等一些?ncRNA?生物生成機(jī)制和調(diào)控通路，甚至在一些人類(lèi)復(fù)雜疾病中的功能，但是這都只是冰山一角。人們對(duì)lncRNA（Long noncoding RNAs，lncRNAs）的認(rèn)識(shí)還處在初級(jí)階段，lncRNA起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能。然而，有文獻(xiàn)研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過(guò)程。lncRNA的這些調(diào)控作用也開(kāi)始引起人們廣泛的關(guān)注。
哺乳動(dòng)物基因組序列中，4%~9%的序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本是lncRNA（相應(yīng)的蛋白編碼RNA的比例是1%）。雖然關(guān)于lncRNA的研究進(jìn)展迅猛，但是絕大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的，隨著研究的推進(jìn)，各類(lèi)lncRNA?的大量發(fā)現(xiàn)，lncRNA?的研究將是RNA?基因組研究非常吸引人的一個(gè)方向，使人們逐漸認(rèn)識(shí)到基因組存在人類(lèi)知之甚少的“暗物質(zhì)”。
近年來(lái)lncRNA得到了研究界的廣泛關(guān)注，人們已經(jīng)在測(cè)序技術(shù)的幫助下鑒定了大量lncRNA，但lncRNA的生物學(xué)功能依然迷霧重重。
西班牙IMIM（Hospital del Mar Medical Research Institute）和加泰羅尼亞理工大學(xué)（UPC）的研究團(tuán)隊(duì)最近在eLife雜志上發(fā)表研究指出，長(zhǎng)非編碼RNA在新蛋白演化中起到了重要的作用，它們?cè)诩?xì)胞中有著不為人知的重要功能。長(zhǎng)非編碼RNA是指長(zhǎng)度超過(guò)三百個(gè)核苷酸的RNA分子，其上沒(méi)有編碼蛋白的閱讀框。在細(xì)胞內(nèi)lncRNA的豐度約占到70%至98%，有些lncRNA甚至長(zhǎng)達(dá)幾千bp。雖然lncRNA沒(méi)有編碼任何蛋白質(zhì)，但它們的表達(dá)在不同組織和發(fā)育階段依然具有特異性，這說(shuō)明lncRNA具有重要的生物學(xué)意義。絕大多數(shù)lncRNA位于細(xì)胞核，它們對(duì)應(yīng)的DNA區(qū)域有的與蛋白編碼基因重疊，有的位于基因之間或者內(nèi)含子中。由于lncRNA似乎沒(méi)有承擔(dān)什么生物學(xué)功能，它們?cè)徽J(rèn)為是一種“進(jìn)化噪聲”?，F(xiàn)在西班牙的研究人員通過(guò)新測(cè)序技術(shù)向人們展示，許多這樣的轉(zhuǎn)錄本也有機(jī)會(huì)翻譯成為蛋白。這一發(fā)現(xiàn)旋即引起了激烈的爭(zhēng)論。
Mar Albà等人在六個(gè)物種中（人類(lèi)、小鼠、魚(yú)、果蠅、酵母和一種植物）驗(yàn)證了這一結(jié)果，許多l(xiāng)ncRNA與核糖體關(guān)聯(lián)，似乎隨時(shí)準(zhǔn)備翻譯成為蛋白。這說(shuō)明，lncRNA可以成為新蛋白合成的資源。這項(xiàng)研究顯示，大多數(shù)lncRNA是種系特異性的，很少有l(wèi)ncRNA存在于兩個(gè)以上的物種中。由此可見(jiàn)，這些lncRNA很可能是最近才演化出來(lái)的。事實(shí)上，lncRNA分子表現(xiàn)出許多與“年輕”基因相似的特性。新功能性蛋白的出現(xiàn)，是一個(gè)反復(fù)嘗試的過(guò)程。因此細(xì)胞需要生成大量的轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本不一定都能通過(guò)時(shí)間的檢驗(yàn)。lncRNA與這樣的轉(zhuǎn)錄本很相符。對(duì)近親物種進(jìn)行研究，將有助于我們進(jìn)一步理解新基因的形成機(jī)制，鑒定那些可能有功能的轉(zhuǎn)錄本。lncRNA表達(dá)模式改變與特定疾病的關(guān)聯(lián)，也是一個(gè)很有吸引力的研究方向。
二、lncRNA的作用機(jī)制
隨著lncRNA功能逐步顯現(xiàn)，其與靶點(diǎn)的作用機(jī)制成為進(jìn)一步的熱點(diǎn)。早期認(rèn)為原位調(diào)控是lncRNA?作用的唯一機(jī)制，它通過(guò)招募形成染色質(zhì)修飾復(fù)合物而沉默鄰近基因轉(zhuǎn)錄，例如IGF2R?反義RNA（antisense of IGF2R RNA，AIR）、XIST?等。而Hox?基因反義基因間RNA（Hox antisense intergenicRNA，HOTAIR）的發(fā)現(xiàn)提示lncRNA可能存在遠(yuǎn)程調(diào)控。
同源異型基因（homeotic genes，HOX）在細(xì)胞增殖與定向分化中起關(guān)鍵作用，人類(lèi)Hox?基因簇約含100個(gè)ncRNA?基因，其中HOTAIR?定位于HOXC?基因座12q13.13。HOTAIR的5'端可招募結(jié)合多梳蛋白抑制復(fù)合物2（polycomb repressivecomplex 2，PRC2），借助PRC2上三個(gè)H3K27甲基化酶EZH2、SUZ12和EED，使另一基因座HOXD上長(zhǎng)約40 kb的序列轉(zhuǎn)錄沉默，從而在乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)使細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄傾向于胚胎成纖維細(xì)胞樣表型。超過(guò)20%的lncRNA?能夠通過(guò)結(jié)合PRC2或其他類(lèi)似復(fù)合物發(fā)揮作用，提示lncRNA的遠(yuǎn)程調(diào)控機(jī)制在生物體內(nèi)廣泛存在。
長(zhǎng)鏈非編碼RNA的作用機(jī)制非常復(fù)雜，至今尚未完全清楚。根據(jù)目前的研究，lncRNA的作用機(jī)制如要有以下幾種。
（1）編碼蛋白的基因上游啟動(dòng)子區(qū)（橙色）轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因（藍(lán)色）的表達(dá)；
（2）抑制RNA聚合酶II或者介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾，影響下游基因（藍(lán)色）的表達(dá)；
（3）與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈（紫色），干擾mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；
（4）與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈（紫色），在Dicer酶的作用下產(chǎn)生內(nèi)源性siRNA；
（5）與特定蛋白質(zhì)結(jié)合，lncRNA轉(zhuǎn)錄本（綠色）可調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；
（6）作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；
（7）結(jié)合到特定蛋白質(zhì)上，改變?cè)摰鞍踪|(zhì)的細(xì)胞定位；
（8）作為小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前體分子。
目前，發(fā)現(xiàn)的參與哺乳動(dòng)物基因活動(dòng)的lncRNA已有上千個(gè)，其調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制存在共性。一般來(lái)說(shuō)，lncRNA主要從表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等3個(gè)層面實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。
1 .表觀遺傳調(diào)控
哺乳動(dòng)物lncRNA介導(dǎo)的表觀遺傳改變的研究，最早源于基因組印記（genomic printing）和X染色體失活（X chromosome inactive）兩個(gè)方面，分別與H19和X ist RNA密切相關(guān)。近十年研究證實(shí)，lncRNA與表觀遺傳調(diào)控密切相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)了許多新的與基因調(diào)控有關(guān)的lncRNA。
2.?轉(zhuǎn)錄調(diào)控
LncRNA能夠通過(guò)多種機(jī)制在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)控，表現(xiàn)在如下幾個(gè)方面：
LncRNA的轉(zhuǎn)錄可以干擾鄰近基因的表達(dá)。例如，酵母的SER3基因受到上游一段lncRNA——SRG1的干擾。近端啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的lncRNA可將RNA結(jié)合蛋白定位至基因啟動(dòng)子區(qū)域從而調(diào)控基因表達(dá)。如，人類(lèi)細(xì)胞中的細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）的表達(dá)，DNA損傷信號(hào)誘導(dǎo)該基因啟動(dòng)子上游一段lncRNA的表達(dá)，它可調(diào)節(jié)RNA結(jié)合蛋白——TLS的活性，接著TLS抑制CREB結(jié)合蛋白——組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶和p300的活動(dòng)，進(jìn)而使CCND1基因的表達(dá)沉默。
LncRNA可作為共因子調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性。例如，小鼠的一段lncRNA——Evf2轉(zhuǎn)錄自一段超保守的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子，它可與轉(zhuǎn)錄因子DLX2形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，并結(jié)合至一個(gè)增強(qiáng)子上，從而誘導(dǎo)鄰近蛋白編碼基因DLX6的表達(dá)。通過(guò)與影響啟動(dòng)子選擇的抑制性復(fù)合物相互作用，封鎖啟動(dòng)子區(qū)域來(lái)調(diào)控RNA聚合酶（RNAP）II的活動(dòng)從而干擾基因表達(dá)。這可能是存在于真核細(xì)胞染色體上的上千種三倍體復(fù)合物結(jié)構(gòu)控制啟動(dòng)子作用的普遍機(jī)制。
再如，小鼠17號(hào)染色體的Igf2r區(qū)是第一個(gè)被證實(shí)的可轉(zhuǎn)錄為?lncRNA的位點(diǎn)，父系染色體上一未拼接的?lncRNA——A irn從母源性Igf2r上的ICR區(qū)域開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，方向與Igf2r相反。這一反義鏈轉(zhuǎn)錄的RNA規(guī)模較大,跨越整個(gè)Igf2r啟動(dòng)子。并越過(guò)基因間區(qū)抵達(dá)鄰近基因。屬于一種轉(zhuǎn)錄干擾機(jī)制。
3 .轉(zhuǎn)錄后調(diào)控
LncRNA在轉(zhuǎn)錄后水平可與mNRA形成雙鏈RNA復(fù)合物，以掩蓋mRNA的主要順式作用元件，從而調(diào)控基因表達(dá)。例如，lncRNA-Zeb2（即Sip1）能夠和HOX位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的mRNA的一個(gè)內(nèi)含子的5’端剪切位點(diǎn)形成雙鏈，從而防止該內(nèi)含子被剪切。該區(qū)域含有對(duì)于Zeb2蛋白表達(dá)所必須的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，Zeb2通過(guò)這種方式能夠提高Zeb2蛋白的表達(dá)量。這一例子說(shuō)明lncRNA可以指導(dǎo)mRNA亞型的選擇性剪接。
另外，lncRNA的復(fù)性（退火）具有靶向作用，使蛋白受體復(fù)合物能夠識(shí)別正義鏈mRNA轉(zhuǎn)錄本。這一租用類(lèi)似于RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）通過(guò)siRNA靶向作用于mRNA。來(lái)自于互補(bǔ)轉(zhuǎn)錄本甚至是lncRNA的雙鏈RNA，結(jié)合延長(zhǎng)的內(nèi)部發(fā)夾結(jié)構(gòu),能夠被加工成內(nèi)源性siRNA以使基因表達(dá)沉默。
