在介紹這個result之前，回顧一下summary中的一句話

Knockdown or knockout of USP38 increases K33-linked ubiquitination, but it abrogates K48-linked ubiquitination and degrdation of TBK1, thus enhanceing type I IFN signaling.

而從題目中我們可以看出，result5正是從實驗角度對summary的這一部分的闡述?，F在進入正題。

因為之前的研究顯示TBK1 和 K48-linked and K63-linked ubiquitination都有關，所以先驗證了一下，發(fā)現

USP38 markedly increased K48-linked, but not K63-linked ubiquitination of TBK1

說明USP38的作用在這里確實是只管K-48

然后

Since the K48-linked ubiquitination of TBK1 is regulated by NLRP4, DTX4, or TRIP protiens

所以看一下是不是USP38通過調節(jié)這些因子來調節(jié)TBK1, 結果

We did not observe any apparent differences in the protein abundance of NLRP4, DTX4, or TRIP in the process or absence of USP38 after viral infection(Figures S4A-S4C)

于是就有了第一段結尾的結果

USP38 regulates K48-linked ubiquitination of TBK1 via a distinct mechanism.

考慮到USP38是DUB，于是他們開始思考USP38是如何通過去泛素化增加而不是減少TBK1 K48-linked ubiquitination

他們利用USP38的突變體C545A, H857A實驗，發(fā)現突變體是不能使TBK1降解的，所以他們就得出了USP38點去泛素化是降解TBK1的前提這一結論。

基于以上實驗他們開始思考USP38會移去和加上哪種ubiquitin chain，于是他們做了這樣一個實驗

We performed experiments using 293T cells expressing FLAG-TBK1, Myc-USP38, and different.types of HA-tagged ubiquitin.

從Figures S4D-S4F中他們發(fā)現了K33-linked ubiquitination 被移去了。再與利用突變體不能移去K33-linked ubiquitination of TBK1這一結果對比，說明K33-linked poly-ubiquitin chain on TBK1的去除是依賴于USP38的去泛素化活性的。

另外，他們還發(fā)現TBK1在病毒感染后會經歷K48-和K33-linked ubiquitination，但是K48-linked ubiquitination是被促進的，所以他們想到了這個

USP38 may remove K33-linked ubiquitin chains and add K48-linked ubiquitin chains to TBK1 after viral infection.

那么K33-linked ubiquitin chains是如何被移去的？K48-linked ubiquitin chains又是如何被加上的呢？

這就不得不提到一個實驗技術

mass spectrometry analysis(質譜分析)

we performed mass spectrometry analysis of ubiquitinated TBK1 from 293T cells or USP38-/-293T cells by VSV infection, using a similar strategy as previously described(2014) ?

并且，作為對比， the increased K33-linked ubiquitinated TBK1和 decreased K48-linked ubiquitinated TBK1 in USP38-/- cell在VSV infection過后會被mass spectrometry analysis發(fā)現

所以有了USP38 is responsible for the cleavage of K33linked ubiquitin chains of TBK1

更深一步的研究是基于 confocal microscopic analysis ，他們發(fā)現

USP38 was colocalized with K33-linked. ubiquitin chains inside the cells, while the co-localization between USP38 and K33-linked ubiquitin chains was enhanced after HSV-1 infection.

所有上面這些研究太多了好難啊最終得出的結論就是

USP38 is responsible for cleaving K33-linked ubiquitin chains from TBK1

至于接上K44-linked poly-ubiquitination of TBK1 at Lys670的問題(從summary之前的圖里面我們可以看到不論是移去還是接上都是在同一位點進行的)，首先是先前研究

NLRP4 induced the K48-linked poly-ubiquitination of TBK1 at Lys670, leading to its proteasomal degration.

而這次更深入的研究目的是介紹發(fā)現在同一位點進行移去和連接的實驗原因

1.neither USP38 nor TRIP can degrate TBK1(K670R) mutants
2.TBK1 K670R mutant abrogates not only K48-linked ubiquitination but also K33-linked ubiquitination of TBK1

(實驗在Figures 5J-S4G 及Figures 5K and S4H)

通過這兩個實驗結果他們得出了

K33-和K48-linked ubiquitin chains may conjugate to TBK1 at the same amino acid position(即Lys670)

那么如何證明這兩個過程只在Lys670位進行呢？

we pulled down the WT TBK1 and TBK(K670R) mutant and checked the ratio of K33 and K48 poly-ubiquitin chains in the immunoprecitates by mass spectrometry analysis

發(fā)現沒有K33和K48 poly-ubiquitin信號在TBK1(K670R) immunoprecipitates

所以！位點只有這一個

最后！終于要完了他們研究了是否K33-linked ubiquitin of TBK1 is more stable than the K48-linked ubiquitinated TBK1

方法是we performed the cycloheximide(CHX) assay and pulled down K33-, K63-, or K48-ubiquitinated TBK1.

這樣就發(fā)現他們的假設是正確的。

最后的最后，也就是我們的結果

USP38 inhibits type I IFN signaling by removing K33-linked and promoting K48-linked poly-ubiquitination chains of TBK1 at Lys670

以上就是這個result的實驗思路和結果的敘述。

那么！傳說中的思考題時間到了！

1.USP38是如何通過K33-linked ubiquitination和K48-linked ubiquitination來控制TBK1的

2.為什么要采用USP38兩種突變體的實驗進行對比

3.為了說明K38-linked ubiquitin chains被移去及K48-linked ubiquitin chains被接上是在同一位點進行的，為什么需要那么多組實驗